2019 Fiscal Year Research-status Report
配偶核形成にて発見した新奇なゲノム切断（DSB）が誘発するクロマチン再構築の研究
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18K06051
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
福田 康弘 東北大学, 農学研究科, 助教 (50527794)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | クロマチン再構成 / テトラヒメナ / DSB / SNF2 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
繊毛虫テトラヒメナは，大核と小核という機能的かつ構造的に分化した 2 つの核を 1 つの細胞内にもつ．大核は約 50 コピーまで多倍数体化したゲノムをもち，遺伝子発現へ特化することで細胞の増殖と維持を担う体細胞系として働く．対して小核は転写活性をもたず，有性生殖（接合）を経て繊毛虫の全ゲノム情報を子孫へ伝える生殖系に相当する．異なる性の細胞がペアを作り接合が始まると，まず小核は減数分裂を行い，そして配偶核が作られる．この配偶核が受精することで生じた受精核が次世代の大核を作り出す．
これまで我々の研究から，減数分裂を終えた小核が配偶核へ発達する過程において，DNA 二重鎖切断（Post-meiotic DNA double-strand breaks: PM-DSBs）に誘起されたクロマチン再構成が起こることが示唆されている．そこでトラヒメナのゲノムから見出されたクロマチン再構成コア酵素，とくに SNF2 ファミリーの全 14 遺伝子について局在を調べたところ，そのうち複数の SNF2 が選択核特異的に局在した．これらのうち 2018 年度はヌクレオソームのスライド能をもつ SNF2 が配偶核形成に不可欠な役割をもつことを明らかにした．そこで 2019 年度は，まずヌクレオソームのスライド能をもつ SNF2 の解析を進めるため，このクロマチン再構成複合体の構成因子解明から始めた．複合体の構成因子解明に重要である回収条件の検討を進め，質量分析を実施する条件を整えた．また 2018 年度の局在解析から明らかになった配偶核特異的 SNF2 について，それらの機能解析を進めた．その結果，これら SNF2 が PM-DSBs 後の DNA 修復に関わることを示唆する結果が得られた．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ヌクレオソームのスライド能をもつ SNF2 クロマチン再構成コア酵素が，配偶核形成において不可欠な役割を担うことを KO 株による機能から明らかにしている．さらに機能解析を進めたところ，この SNF2 が配偶核の de novo クロマチン構成，さらに PM-DSB 後の DNA 修復の両者に関わることが明らかになった．そこで，この配偶核形成に不可欠な SNF2 が作るクロマチン再構成複合体のサブユニット特定を試みた．サブユニットの特定は，タグ付加 SNF2 を用いた共免疫沈降法で進めた．タグの種類，回収 Buffer などの条件検討を行い，複合体を沈降できる条件が得られた．現在は質量分析を進めており，サブユニットはまもなく特定されるだろう．
また他の配偶核特異的 SNF2 についても機能解析を進めた．その結果，これら SNF2 3 分子も PM-DSBs 後の DNA 修復に関わることを示唆する結果がえられた．そこで前述と同様の解析をすすめている．
これらは，本申請研究が解明を目指している「配偶核形成に関わる PM-DSB に誘起されたクロマチン再構成の分子機構」の骨子にあたる知見の発見といえる．これを根拠として，本研究は順調に進展していると判断した．
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでの本研究から，4 つの SNF2 が配偶核形成のクロマチン再構成に関与することが明らかになった．2020 年度の研究では，これら SNF2 の詳細な機能解析を以下のように進める．
1）共免疫沈降報によるタンパク質間相互作用
SNF2 は多数のサブユニットを含むクロマチン再構成複合体の酵素活性中心である．したがってクロマチン再構成の様式やメカニズムの解明には，複合体を構成するサブユニットの特定が重要である．そこで SNF2 を Prey とする共免疫沈降と，共沈降タンパク質の質量分析を行う．本解析はいち SNF2 について昨年度から進めているが，これによって SNF2 へ付加するタグの種類や沈降条件のキーポイントが判ってきた．この知見を活用して，他 3 つの SNF2 について複合体解析を進め，配偶核形成のクロマチン再構成にかかる機械的メカニズムを明らかにする．
2)配偶核のヒストンで特異的に生じるヒストンおよび DNA のメチル化の解析
ゲノムのエピジェネティクスな変化は，おもにクロマチン再構成因子とヒストン修飾が主な要因である．後者について，ヒストン H3/H4 の多くのリシン残基がアセチル化されることを我々は明らかにしている．リシン残基アセチル化はメチル化を対とする現象である．また配偶核へ分化する前の小核では，リシン残基の多くはメチル化されていることもよく知られている．そこで配偶核形成過程におけるリシン残基メチル化・脱メチル化について解析する，これはメチル化認識抗体の特異性検証，ならびに同抗体を用いた免疫染色で進める．
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| Causes of Carryover |
すみやかな実験の進捗により，消耗品費を抑制することができたため．この予算は2020年度に実施する質量分析の受託解析費用に活用したい．
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