2020 Fiscal Year Research-status Report
配偶核形成にて発見した新奇なゲノム切断（DSB）が誘発するクロマチン再構築の研究
| Project/Area Number |
18K06051
|
|---|
| Research Institution | Tohoku University |
|---|
Principal Investigator |
福田 康弘 東北大学, 農学研究科, 助教 (50527794)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2022-03-31
|
| Keywords | DSB / クロマチンリモデリング / DNA修復 / テトラヒメナ / 原生生物 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は、繊毛虫テトラヒメナの配偶核形成から見出された減数分裂後の DNA 二重鎖切断（PM-DSB）が誘起するクロマチン再編成について、その分子メカニズムとエピゲノムな変化を明らかにすることである。
２０２０ 年度はクロマチン再構成因子に注目して、配偶核形成におけるそれらの関与を解析した。まずスクリーニングとして、蛍光タグタンパク質を融合したクロマチン再構成因子を発現する細胞を作製し、蛍光シグナルが PM-DSB を経た配偶核に局在するか調べることで、配偶核形成に関わる候補分子の特定を行った。その結果、配偶核に局在する複数のリモデリング因子が新たに特定された。続いて、これら遺伝子について欠損ならびに発現抑制細胞を作製して機能解析を試みたところ、それらの一部は配偶核形成において不可欠な役割を果たしていることが明らかになった。とくに重要な発見は、クロマチン再構成因子を欠損することは、クロマチン構造の転換（ヘテロクロマチンからユークロマチンへの変化）のみならず、PM-DSB の修復においても不全を起こすことであった。
これらの新たに得られた知見について、減数分裂後の DNA 二重鎖切断ならびにその修復との関係性をふまえて考察する。新たに特定されたクロマチン再構成因子において、その欠損はクロマチン構造の転換ではなく、PM-DSB の修復における不全をもたらした。このことから、DSB が誘発するクロマチン再編成は、DSB 修復と一体的に制御・実行される現象であることが示唆される。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
さまざまなクロマチン再構成因子について機能解析を進めるため、一昨年度末から蛍光タグタンパク質融合発現細胞や欠損・発現抑制細胞を作製してきた。だが、COVID-19 の感染拡大と、その対応として研究室での研究活動時間の制限をうけて、一部の細胞株の維持が困難になり、やむを得ず一時的に廃棄（凍結保存は困難であるため、制約の緩和後に改めて作成）せざるを得なかった。技術的には、これらの未解析遺伝子について、遺伝子組み替え細胞株を作製することは容易である。しかし組み替え細胞のクローンのスクリーニングでは ２－３ ヶ月もの時間を要するため、この時間について研究の進展が遅延している。
|
| Strategy for Future Research Activity |
標的としたクロマチン再構成因子の解析を引き続き進める。すなわち、局在解析から PM-DSB を介した配偶核形成に関与する分子種の候補遺伝子をスクリーニングし、それらの機能を欠損・発現抑制の解析から明らかにする。このパターン化した解析を繰り返し、配偶核形成におけるクロマチン再構成因子のカタログを作製する。
PM-DSB の導入と修復を介した配偶核のエピゲノムな変化について、ヒストン修飾の変化をリスト化する。これは、市販されているヒストン修飾特異的抗体の特異性検証と、バリデートされた抗体の免疫蛍光観察によって進める。
|
| Causes of Carryover |
COVID-19 の影響による組み替え細胞の維持管理が困難になり、実験の進展が遅れた。この遅延により、はじめの計画に沿った消耗品や受託解析の進展にも影響が及び、本研究計画を 1 年間延長した。次年度使用額が生じたのは、この理由によるものである。
実験室で行う実験が遅延したが，その時間でゲノム情報に基づく in silico 解析を進めたところ，本研究の標的となりうるクロマチン再構成因子の新たな候補遺伝子が得られた．そこで次年度は，これらの遺伝子について，局在や遺伝子欠損・発現抑制などを用いた機能解析を進める．
|
