クロマチン制御因子TAF-Iによるヒトテロメアの構造と機能の制御機構

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K06052
• Research Institution: University of Tsukuba
• Principal Investigator: 加藤 広介 筑波大学, 医学医療系, 助教 (90466673)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: テロメア / テロメラーゼ / がん / クロマチン / エピジェネティクス / ヒストンシャペロン

Outline of Annual Research Achievements

本研究課題では、哺乳類細胞のクロマチン制御因子TAF-Iによるテロメアの構造と機能の制御機構を解明することを目的とし、(1)テロメラーゼ酵素サブユニットをコードするTERT遺伝子のTAF-Iによるエピジェネティックな転写制御機構の解明、および(2)TAF-IによるテロメアDNA-タンパク質複合体を介したテロメアの制御機構の解明の２つを目的とする。
(1)について、これまでに申請者はヒト子宮頸がん由来のHeLa細胞において、TAF-Iの発現抑制により、TERT遺伝子転写開始点近傍のDNAメチル化が亢進され、これによりTERT遺伝子の転写が抑制されることを見いだした。これがHeLa細胞に特異的か、あるいは他の組織由来のがん細胞でも同様に起こるのかを明らかにするため、肺がん由来のA549細胞、および大腸がん由来HCT116細胞を用いてTAF-Iの発現抑制細胞株を樹立したところ、HeLa細胞と同様に、A549細胞およびHCT116細胞でもTAF-Iの発現抑制によりTERT遺伝子転写開始点近傍のDNAメチル化の亢進と、TERT遺伝子の発現低下が観察された。以上の結果より、TAF-Iは様々な組織由来のがん細胞において、エピジェネティックな機構によりTERT遺伝子の転写制御に関わることを明らかとした。またTAF-IによるTERT遺伝子のDNAメチル化制御には、転写因子Sp1が関与する可能性も見いだした。以上の結果をまとめた論文を投稿中であり、現在リバイス後の査読結果を待っているところである。
(2)については、2020年度は(1)の実験ならびに結果の論文投稿に多くの時間を費やしたため、あまり進行することが出来なかったため、まずTAF-Iによるテロメア結合タンパク質TRF1およびTRF2の機能制御機構を生化学的に解析していく予定である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

TAF-IによるTERT遺伝子のエピジェネティックな転写制御機構の解明については、TAF-IがDNAメチル化およびヒストン修飾を介してTERT遺伝子の転写活性化に関わることを明らかにした。また、それが様々な組織由来のがん細胞で起こりうることを明らかにし、TAF-Iによるがん形質の促進が普遍的な機構である可能性が示唆された。その分子メカニズムについては完全な解明には至らなかったが、転写因子Sp1が本機構において重要な役割を果たす可能性を見いだした。これらの結果に関しては、現在論文にまとめて投稿中であり、リバイスの査読結果待ちの状態である。このため、おおむね順調に進展したものと考えている。TAF-Iによるテロメア結合タンパク質TRFを介したテロメア機能の制御については、2020年度はTAF-IによるTERT遺伝子の転写制御機構に多くの時間を費やしたため、当初予定ほど進行出来なかった。しかし、TAF-IとTRF1およびTRF2の組換えタンパク質の発現精製系は確立間近であり、速やかにこれら精製タンパク質を用いて相互作用解析などを行うことが可能な状態である。これにより、TAF-Iとの相互作用活性を失うようなTRF1およびTRF2の変異体を作製し、それら変異体を細胞に導入した際に起こるテロメア構造と機能への影響を検証する。

Strategy for Future Research Activity

TAF-IによるTERT遺伝子の転写制御機構については、今後はまず詳細な分子メカニズムの解析を行っていく。特に本機構においてSp1が関与する可能性が示唆されていることから、Sp1の発現量の変化がTERT遺伝子座のDNAメチル化状態にどのような影響を与えるか、またSp1の機能についてTAF-Iの発現量変化がどのような影響を及ぼすかなどを明らかにしていく。また、TAF-Iが実際に細胞のがん形質にどのような影響を与えるかについて、TAF-Iの発現を抑制した各種がん細胞の増殖能や転移能、幹細胞形質などへの影響を検証していく。さらに、免疫不全マウスへTAF-Iの発現を抑制した各種がん細胞を移植することにより、哺乳類個体でのTAF-Iのがん細胞増殖への影響を検証する。TAF-Iによるテロメア結合タンパク質TRFを介したテロメア機能の制御については、TAF-IとTRF1およびTRF2の組換えタンパク質を調製し、相互作用解析やTAF-IがTRFのテロメアDNAの結合活性に与える影響の解析を行う。これにより、TAF-Iとの相互作用活性を失うようなTRF1およびTRF2の変異体を作製し、それら変異体を細胞に導入した際に起こるテロメア構造と機能への影響を検証する。

Causes of Carryover

本研究課題の研究成果の一部をまとめた論文1編を現在投稿中（現在審査中）であり、その際に審査員から非常に多くの追加実験を要求された。また、本研究課題に関連する別の研究成果についても、別の論文1編としてまとめる予定である。論文の掲載をもって本研究課題を完遂とするためには、次年度まで追加実験の対応を行う必要があったため、令和2年度で終了予定であった本補助事業期間を令和3年度まで延長することとなった。令和3年度に延長した助成金は、主には現在審査段階にある論文に関連した追加実験に必要な消耗品の購入と、当該論文が受理された場合に必要な掲載費に使用する予定である。また、もう一つの論文にまとめる予定の研究に必要な消耗品の購入にも使用する予定である。