2018 Fiscal Year Research-status Report
哺乳類ミトコンドリアの新生ペプチド鎖リボソーム複合体の構造解析
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18K06054
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
富田 野乃 (竹内野乃) 東京大学, 大学院新領域創成科学研究科, 准教授 (80323450)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 翻訳 / リボソーム / ミトコンドリア |
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| Outline of Annual Research Achievements |
近年、ミトコンドリア翻訳因子の病的変異が相次いで同定されており、またミトコンドリアのリボソーム(mtリボソーム)に誤作用して副作用をもたらす薬剤も報告されている。mtリボソームの機能構造相関を解明する必要性が高まっている。
リボソームのペプチドトンネルは、新生ペプチド鎖のプロセシングや折りたたみ、細胞内輸送などの制御をになう場であり、多くの抗生物質の結合部位となっている。哺乳類ミトコンドリアで合成されるタンパク質は全て膜タンパク質であり、翻訳と共役して膜に挿入される。これと関連して、mtリボソームのペプチドトンネルはmtリボソームに特化したリボソームタンパク質から構成されることが示唆されており、これはバクテリアや真核細胞のリボソームのトンネルとも異なるユニークなものである。現在ペプチドトンネルの候補として、２つのトンネル（間隙）が見いだされているが、どちらが利用されているのか不明である。本研究では、申請者が確立したミトコンドリア由来再構築型生体外タンパク質合成系(mtPURE system)を利用して新生ペプチド鎖・リボソーム複合体（RNC）を形成させ、その構造をCryoEM構造解析により決定することとした。
Twin Strep Tagの下流に連続プロリン配列およびルシフェラーゼをコードしたmRNAを用意し、mtPURE systemで翻訳することにより、内部連続プロリン配列で翻訳が停止したRNCを得ることに成功した。ストレプトアビジン誘導体結合樹脂を利用してRNCをアフィニティー精製できる。mtリボソームで連続プロリン配列による翻訳停止を観察したのは初めての例である。mtリボソームのペプチドトンネルの構造、新生ペプチド鎖とトンネルの相互作用、更に、連続プロリン配列による翻訳停止機構の普遍原理を解明できると期待している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
当初、mtPURE systemから翻訳終結因子RF1Lmtをのぞくことにより人為的に翻訳を停止させ、新生鎖（ATP8由来）を有するRNCを得る予定であった。しかし、翻訳条件の至適化を重ねることにより、mtPURE systemでnLuciferaseを合成することが可能になり、さらに連続プロリン配列によって翻訳を停止させたRNCを形成する条件を見出すことができた。この複合体の構造を決定することにより、新生ペプチド鎖による翻訳停止機構も解明できるため、当初の計画以上に進展していると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
十分量の新生ペプチド鎖リボソーム複合体を得たのち、グリッドの作成、イメージの取得と解析、モデリングを順次進める。
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| Causes of Carryover |
翻訳条件を改善することにより、より学術的意義の高いリボソーム複合体種を得られることが判明した。当初、海外共同研究先にてリボソーム複合体の構造解析を直ちに開始する計画であったが、新たなリボソーム複合体で構造解析を行うため、渡航を延期したため。
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