2019 Fiscal Year Research-status Report

Development of a live cell imaging method for visualization of epigenetic dynamics at a single locus

Research Project

Project/Area Number	18K06062
Research Institution	Kyushu University
Principal Investigator	岡田悟九州大学, 医学研究院, 助教 (30734488)
Project Period (FY)	2018-04-01 – 2021-03-31
Keywords	BiFC / CRISPR/Cas / 出芽酵母
Outline of Annual Research Achievements	ヒストンの翻訳後修飾は、DNAのメチル化と並んで、エピジェネティック制御の中核をなす分子機構である。その制御メカニズムの動的側面を理解するためには、「どのタイミングで」「どの細胞において」「どの種類の修飾が」「ゲノム上のどの位置で」生じるのかを調べることが必要不可欠である。しかし、現時点においてこれらすべての情報要素を同時に取り出すことのできる手法は存在しない。本研究は、既存手法の限界を克服することを目指し、CRISPR/Cas9システム、ヒストン修飾認識ドメイン、Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC)を組み合わせて利用することで、上記の情報要素すべてを同時に取り出すことのできる、すなわち、「特定の遺伝子座」での「ヒストン修飾の変化」を「単一の生細胞内で検出する」ことのできる独自のイメージング手法を開発することを目的とするものである。今年度は、昨年度に引き続き、単一遺伝子座におけるヒストン修飾の変化を可視化することを指向したBiFCの高度化を試みた。昨年度までに確認した、GFP結合タンパク質によるBiFCシグナルの増強効果は、幅広い蛍光タンパク質・幅広い相互作用タンパク質ペアに適用できる可能性が示唆された。 dCas9-sgRNA複合体上でのBiFCマルチマー化に向けて、Rad52イメージングに基づく手法を利用して、sgRNA分子内でステムループ挿入が許容される位置の探索をおこなった。その結果、テトラループを延長するかたちでステムループを挿入した場合には、sgRNAの機能が保たれることが確認された。今後は、GFP結合タンパク質によるBiFCシグナルの増強効果の汎用性を確認するとともに、BiFCのマルチマー化による高輝度化を試みる予定である。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 単一遺伝子座におけるBiFCシグナルを検出可能な程度まで増強するためには、タンパク質ペアひとつに由来するBiFCシグナルを増大させることが必要不可欠である。しかしながら、これまでBiFCの効率を上昇させる方法は開発されてこなかった。昨年度までに、出芽酵母Cse4間相互作用を利用したモデル系においては、GFP結合タンパク質の同時発現によって、黄色蛍光タンパク質VenusのBiFCシグナル強度を高めることができることを確認した。今年度は、この手法の一般性を確認することを試みた。Cse4に代えて、核小体内で相互作用することが既知であるタンパク質Net1およびSir2にVenus BiFCタグを付加した場合でも、GFP結合タンパク質の同時発現によりBiFCシグナル強度が増強された。同じNet1-Sir2系において、Venusに代えて緑色蛍光タンパク質mClover3 BiFCタグをタグを利用した場合でも、GFP結合タンパク質の同時発現によりBiFCシグナル強度が増強された。以上の結果から、GFP結合タンパク質によるBiFCシグナルの増強はVenus BiFCタグを付加したCse4に限られず、Venus以外の蛍光タンパク質に由来するBiFCタグやCse4以外のタンパク質ペアにも適用できることが示された。 dCas9のsgRNAにステムループを挿入して利用する場合には、その挿入位置によってはsgRNAの機能が阻害されてしまう。Rad52のイメージングによってsgRNA機能性を評価する手法を確立し、これを利用してステムループの挿入が許容される位置を探索した。その結果、sgRNAの5’末端、3’末端はどちらもステムループの挿入を許容しないことが分かった。sgRNA内部のテトラループを延長した形でステムループを挿入した場合には、sgRNAの機能が阻害されなかった。
Strategy for Future Research Activity	GFP結合タンパク質によるBiFCシグナル増強効果の汎用性を確認する。具体的には、出芽酵母バッドネックに局在するセプチンや液胞膜局在タンパク質をターゲットとしたBiFCを評価対象とすることで、核内タンパク質だけではなく、核外に局在するタンパク質に対してもBiFC GFP結合タンパク質によるBiFCシグナル増強効果が見られるかどうかを確認する。 Rad52ベースの手法をSaCas9のsgRNAの機能性評価にも適用する。これによって、SaCas9のsgRNA内でステムループ挿入を許容する位置を探索する。dSpCas9のsgRNA内にMS2ステムループを挿入し、dSaCas9のsgRNA内にはPP7ステムループを挿入する。十分に近接したサイトをそれぞれのsgRNAのターゲットとし、dSpCas9、dSaCas9、MS2コートタンパク質-N末側BiFCフラグメント、PP7コートタンパク質-C末側BiFCフラグメントの四者を同時に発現させる。これによって、タンパク質ペア一組によって再構成される蛍光タンパク質の分子数を増大させる。ここにさらにGFP結合タンパク質を発現させることで個々のBiFC効率を上昇させることで、得られるBiFCシグナルを最大化することを試みる。
Causes of Carryover	（理由）昨年度までに研究代表者の所属する研究室に高感度EMCCDカメラが導入され、部局共通機器室の共焦点顕微鏡を使用する必要がなくなり、共通機器利用料の支払い経費分のコストを削減できたため。既存の試薬・プラスミドを積極的に活用することで物品費のコストを削減できたため。（使用計画）生細胞イメージングの時間解像度の向上を企図して、対物レンズ駆動向けピエゾ素子の購入に充てる計画である。