Interaction between nuclear lamina and heterochromatin during G1 phase

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K06066
• Research Institution: University of Hyogo
• Principal Investigator: 廣瀬 富美子 兵庫県立大学, 生命理学研究科, 准教授 (60208882)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: 核ラミナ / ヘテロクロマチン / G1期

Outline of Annual Research Achievements

転写が抑制された状態のヘテロクロマチンと転写が盛んなユークロマチンは核内で住み分けをしている。核膜付近にはヘテロクロマチンが配置され、この状態は細胞分裂を越えて娘細胞へ受け継がれる。動物細胞は細胞分裂期（M期）には、クロマチンは染色体へのダイナミックな高次構造の変換が起こるが、G1期には再び核膜付近にヘテロクロマチンが分布する。細胞周期ごとに繰り返されるクロマチンの再配置が起こる詳細なタイミングやこれに関わる因子については未解明である。本研究では、ヘテロクロマチンの核膜付近への配置に関与することが知られている核ラミナの構成因子ラミンＡをツールに用いて、ヘテロクロマチンの核膜付近への配置が規定される時期と、この反応に関わる因子の同定を目指している。初年度は、分裂期の終了からG1期にかけての核ラミナとヘテロクロマチンをライブイメージングを行う準備として、Lamin Aといくつかのヘテロクロマチン結合因子を蛍光たんぱく質との融合たんぱく質として培養細胞で発現させ、観察に適した条件検討を行った。また、SUMO化依存的にLamin Aと結合する因子の精製の条件検討を行った。全長のLamin Aを用いての免疫沈降では、Lamin Aがポリマーを形成するために細胞からの抽出や結合因子の見極めに問題があった。そこで、いくつかの欠失変異体Lamin Aを作成し、免疫沈降実験に適したLamin A変異体を検索した。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

Lamin Aが結合するクロマチン領域を可視化するために、LacO(大腸菌のLacIリプレッサー結合配列)を200リピート程度縦列に連結したものをゲノム編集によりHeLa細胞ゲノム上のLADs配列内に挿入し、一方で、LacI-GFP融合タンパク質の発現プラスミドを作成する予定であったが、手つかずである。また、免疫沈降法でlamin Aの相互作用因子を精製する準備を整え、精製を開始する予定であったが、細胞からの抽出条件や免疫沈降の条件の検討に時間を費やしてしまい、実際の精製を開始することができなかった。

Strategy for Future Research Activity

免疫沈降沈降の条件は整え、小さなスケールでlamin Aと相互作用するSUMO化因子の精製を試したが、再現性に問題があることが分かった。これは、lamin Aの発現量や、細胞内でのSUMO化の程度、実験の迅速性などを安定させないとうまくいかないような印象を受けている。今後は、再現性の高い結果が得られるように技術的に熟練することが重要であると考える。同時に、免疫沈降法以外の採用も必要であるかもしれないと考えている。具体的には、組換え体Lamin Aを固定化したカラムを用いたアフィニティー精製についても検討する予定である。
Lamin Aが結合するクロマチン領域の可視化については、準備が整い次第開始する予定である。

Causes of Carryover

初年度は生化学的な実験の条件検討を主として行った。すべての実験を小規模に行ったため、当初の予定より経費がかからなかった。また、実験に用いる共焦点顕微鏡が年度中に故障し、3か月程度使用できず、抗体染色やライブイメージングなどに予定していた消耗品の使用も当初の予定より少なかったことなどが原因で次年度使用額が生じた。次年度は、初年度に予定していた内容を遂行することで助成金を適切に使用する予定である。また、次年度は細胞培養や樹立細胞のストックなどにさらなる経費が必要である。例えば、培養に必要なウシ血清や細胞の貯蔵に用いる液体窒素タンクなどの購入に充てる予定である。