2018 Fiscal Year Research-status Report
Mechanisms inducing functional switching of Dnmt1 initiated by chromatin reprogramming and its physiological function
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18K06068
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| Research Institution | Toho University |
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Principal Investigator |
多田 政子 東邦大学, 理学部, 教授 (10524910)
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2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | DNAメチル化 / Dnmt1 / DNAメチル基転移酵素 / ES細胞 / マウス / 発生分化 / 網羅的解析 / 遺伝子発現 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
DNAのメチル化は、哺乳類の初期胚発生制御に重要である。DNAメチル基転移酵素には、無修飾ゲノム領域をメチル化するDnmt3aとDnmt3b、そのパターンを維持するDnmt1がある。これらを全て欠損した三重欠マウス胚性幹細胞(TKO ES細胞)は分化能を失う。我々は、Dnmt1を強制発現させたTKO ES細胞（TKO+1 ES細胞）は、分化能を再獲得することを見出した。本研究の目的は、TKO+1 ES細胞の分化過程で、Dnmt1が無修飾ゲノムをメチル化する制御機構を明らかにすることにあり、特に、クロマチン構造との相互関係に注目した。
2018年度は、Dnmt1による新規DNAメチル化活性が顕在化するTKO+1 ES細胞の分化段階やクロマチン構造を解析した。 (1) DNAメチル化とその酸化体5-ヒドロキシメチルシトシンの総量を解析し、Dnmt1は未分化なTKO ES細胞ゲノムをメチル化せず、分化に伴ってメチル化することを再確認した。この違いは、Dnmt1酵素の修飾変化ではなく、Dnmt1のターゲット領域の発生段階特異的クロマチン緩和によるアクセス許容性変化により制御されている可能性を見出した。このことは、クロマチンを活性化するリガンドや低分子化合物を加えると、未分化TKO+1 ES細胞に新規メチル化が誘導されたことから支持された。(2)分化誘導プロセスにおけるmRNA発現を網羅的に解析し、原条形成や始原生殖細胞マーカーを高発現する核の状態を経過するとDnmt1によるDNAメチル化が増加することを確認した。
2019年度は、現在開始しているバイサルファイトシークエンスによるTKO+1 ES細胞における新規メチル化領域の網羅的解析と今後予定しているATAC-seqによるオープンクロマチン領域の網羅的解析の結果を照らし合わせ、Dnmt1活性とクロマチン構造との関連性を探る。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
Dnmt1は、精製した無修飾DNAをメチル化できるが、細胞の中で新規メチル化活性をもつか明らかになっていない。我々は、CAGプロモーター下でDnmt1を強制発現させた2株のTKO+1 ES細胞を入手して分化誘導し、TKO+1 ES細胞がDnmt1によって分化能を再獲得したことを見出した。この結果は、Dnmt1が分化に必要なDNAメチル化を付加できることを示す。次に、TKO ES細胞をネガティブコントロール、親株のES細胞をポジティブコントロール、Dnmt3a/3bの二重欠損ES細胞を内在性Dnmt1を発現するコントロールとし、Dnmt1がどのようにTKO+1 ES細胞ゲノムをメチル化するか解析した。
5mCはTet酵素によって5hmCへ変換されるため、Dnmt1の活性は5mCと5hmCに対する細胞免疫染色のシグナル総量として評価した。結果、Dnmt1は、未分化ES細胞ではメチル化できず、分化に伴ってメチル化できるようになることを見出した。Dnmt1の新規メチル化活性は、(1)Dnmt1のN末端領域の修飾の違いや(2)ターゲットDNA領域のクロマチン構造の違いによって制御され得る。N末端を欠損したDnmt1にも新規メチル化活性を見出したことから、(1)の可能性は低いといえる。次に、シグナル経路の下流でクロマチンを活性化するリガンドや低分子化合物(Activin A, HDAC阻害剤, G9a阻害剤など)を加え、クロマチン活性化とDnmt1によるDNAメチル化との関連性を調べた。結果、TKO+1 ES細胞は、短時間で5mC/5hmC化された。以上から、Dnmt1の新規メチル化活性は通常ヌクレオソーム構造によって阻害されているものの、特殊なクロマチン緩和状態になるとDnmt1の新規メチル化活性が顕在化すると考えられた。以上の結果は、Dnmt1の新たな特性を示すものであった。
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| Strategy for Future Research Activity |
2018年度は仮説をさらに検証するため、TKO+1 ES細胞をエピブラストから中内胚様性の細胞へと分化誘導し、5mCと5hmCのICCシグナル総量が最も高くなる分化段階でどのような遺伝子発現のプロファイルを示す細胞へと分化しているのかを明らかにする目的でmRNA発現を網羅的に解析した。結果、定量性RT-PCR(RT-qPCR)法による解析結果と同様に、原条形成や始原生殖細胞マーカーを高発現する状態を経過していることを確認した。このとき、H3K9me3の大幅な消失を伴っていた。よって、胚発生における生殖系列の分化はWnt/Nodal/Bmpシグナルの連続的活性化誘導されるが、これらシグナル経路によって核のリプログラミングも誘導される.Dnmt1による新規メチル化は、これらの現象に連動して起こる可能性が高い。しかし、実際、胚発生の生殖系列分化過程において、Dnmt1の新規メチル化活性が働いているのかどうか、もし働いているのなら、その生理的な機能は何かなど未だ不明な点が多く残されている。
今後の推進方法：
2019年度は、現在進めている全ゲノムバイサルファイトシーケエンス(BS-seq)によるDnmt1の新規メチル化活性に由来する5mCと5hmCの局在性の網羅的解析から得られた結果を詳細に評価する。また、オープンクロマチン領域を網羅的に解析できるATAC-seq法を用いてクロマチン構造を解析する。これらを対比し、Dnmt1が作用するゲノム領域の特性を探る。このBS-seq解析に関して、新たに九州大学と共同研究体制を構築した。
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| Causes of Carryover |
研究の進捗上、全ゲノム解析が必要となった。その解析予算は、2019年度の予算では明らかに不足であった。そこで2018年度予算を60万円繰り越すことで、2019年に200万円の予算を確保した。これにより網羅的オープンクロマチン領域解析を実施できる目処がたった。
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