2018 Fiscal Year Research-status Report
植物の記憶消去メカニズムの解明；忘れられない変異体に着目して
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18K06069
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| Research Institution | Nihon University |
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Principal Investigator |
土屋 徳司 日本大学, 生物資源科学部, 講師 (80758459)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | エピジェネティクス / シロイヌナズナ / 記憶 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
植物は環境ストレスを一度経験すると、経験していない植物と比較した場合に、２度目のストレス時により強い耐性を発揮できる。このように、植物は乾燥などの環境ストレスを記憶し、２次的なストレスに備える能力を持つ。一方で、不必要な記憶による長期間にわたる恒常的な耐性発現は、適応にはらう犠牲（フィットネス・コスト）を増加させる。したがって、植物環境適応には記憶の保持と消失のバランスが適切に制御される必要があると考えられるが、記憶の形成および消失に関する分子メカニズムには不明な部分が多い。我々は植物環境記憶の分子メカニズムの解明を目的として、本年度は以下の解析を行った。
記憶の保持と消失のバランスを失ったエピジェネティック因子機能欠損変異体を材料とし、次世代シークエンサーを用いたトランスクリプトームのプロファイリングを行った。変異体と野生型のトランスクリプトームを比較することで、記憶を成すエピジェネティック情報により制御される遺伝子群が同定されると期待した。解析の結果、変異体と野生型間で発現が変動している遺伝子として、従来から知られている複数のストレス応答性遺伝子が検出された。加えて、トランスポゾンや遺伝子間領域から転写される非コードRNAの量にも差異が見られた。これらの結果より、植物環境記憶の形成および消失において役割を果たす生体分子として非コードRNAが見出された。
2019年度では、このエピジェネティック因子が直接結合するゲノム領域を同定するためにクロマチン免疫沈降（ChIP）を行う計画である。その際に、エピジェネティック因子の機能欠損変異体をバックグラウンドとするタグ付きタンパク質を発現する形質転換体を実験材料として用いる。今年度に作出した形質転換体は変異体表現型が相補されたことから、問題なくChIPに使用できると考えられる。このように、次年度へ向けた準備を進めることもできた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究課題では研究期間を3年と設定し、初年度にトランスクリプトーム解析を実施し、その結果により同定された発現変動遺伝子群に関して次年度以降に解析していく計画となっている。従って、トランスクリプトーム解析の可否がプロジェクト全体の成否を決める大きな要因となる。2018年度に実際にトランスクリプトーム解析を行い、予測していたストレス応答遺伝子のみならず非コードRNAを発現変動遺伝子として同定することができた。このように、遺伝子発現制御を行う分子の一つとして近年大変注目されている非コードRNAが植物ストレス記憶に関わるという可能性を見出すに至ったことから、今回行ったトランスクリプトーム解析では十分な成果が得られたと考える。
2019年度では研究対象としているエピジェネティック因子が直接結合する発現変動遺伝子座をChIPにより検出する予定である。この実験を行うためには、変異体を相補する導入遺伝子をホモ接合型で持つ形質転換体が必要となるため、形質転換体の世代を進める時間が必要となる。そこで2018年度に形質転換体の作成を進め、現在は導入遺伝子をホモ接合型に持つ形質転換体を得るに至った。これにより2019年度に計画している実験も遅れることなく進めることができる。
以上のように、研究計画はおおむね順調に進展している。しかしながら、予備実験で得られていた乾燥ストレスによる変異体の形態形成に関する表現型の再現性がとれないことがあった。この点に関しては2019年度も継続して検証する必要がある。
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| Strategy for Future Research Activity |
2018年度に行ったトランスクリプトーム解析により同定された環境ストレス記憶変異体における発現変動遺伝子群の中には、研究対象としているエピジェネティック因子がクロマチン領域へ直接結合して転写制御をおこなっているもの、あるいは間接的に影響を受けているものがあると推察される。これらの遺伝子群の中でも、エピジェネティック因子が物理的に結合し、直接的に発現を制御する遺伝子が、植物ストレス記憶を構成する遺伝子ネットワークのより上流に位置しており、機能的に重要な遺伝子であると考える。そこで2019年度では、FLAGタグ融合エピジェネティック因子により相補した形質転換体を実験材料とし、抗FLAG抗体を用いたクロマチン免疫沈降と定量PCR（ChIP-qPCR）により、エピジェネティック因子が直接結合するゲノム領域の検出を行う。トランスクリプトーム解析で特定した遺伝子群に含まれる遺伝子領域およびプロモーター領域をChIP-qPCR解析の対象とする。この実験で用いる形質転換体は、2018年度に既に作成済みなため、現時点では研究計画の実行に問題点はない。
研究対象としているシロイヌナズナのエピジェネティック因子には相同性を持つパラログが存在することから、機能重複が考えられる。現在、それらのファミリーメンバー間での2重変異体の作出を試みている。当初の研究計画にはなかったが、2019年度に行う研究においては、この2重変異体も実験材料として用いる予定である。
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