2018 Fiscal Year Research-status Report
脱ユビキチン化酵素USP10が制御するDNA損傷応答機構の解析
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18K06070
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| Research Institution | Kanazawa Medical University |
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Principal Investigator |
宇谷 公一 金沢医科大学, 医学部, 助教 (60583143)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
樋口 雅也 金沢医科大学, 医学部, 教授 (50334678)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | DNA損傷応答 / 脱ユビキチン化酵素 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ユビキチン化システムの異常は、癌および変性疾患を含む多くの疾病の根本原因となることが示されている。当研究室の樋口らは、蛋白質からユビキチンを切断する脱ユビキチン化酵素であるUbiquitin Specific Protease 10 (USP10) が、ストレスによって誘導される活性酸素（ROS）の産生を抑制する制御分子であること、さらに、USP10 のノックアウト（KO）マウスは造血幹細胞（Hematopoietic Stem Cell: HSC）が維持されないことに起因する骨髄造血不全をともなう重度の貧血に陥ることを明らかにした。
HSC維持に関わるストレス応答として、小胞体ストレス応答、オートファジー、DNA 損傷応答（DNA damage response；DDR） などが知られているが、HSC のストレス応答時に、どのような蛋白質がUSP10 により脱ユビキチン化され、いかにしてHSC の維持に寄与しているか、その作用機序は不明である。
本研究に先立ち、USP10-KO 細胞では、DDR過程に異常をきたし、染色体不安定性を呈していることが示唆された。 そこで、本研究では、USP10-KOによって生じるDDR の異常個所を特定することで、DNA ダメージ蓄積の分子メカニズムを解明し、HSCの消失、癌発生や老化との関連について検討することを目的とした。
研究計画に従い、USP10がマウス細胞に限らずヒトがん細胞でもDDR に必要な分子であることを確認した。またその分子機構を解析し、Non-Homologous-End Joining (NHEJ) 経路を司るDNA-PKcs 蛋白質が不用意に活性化しており、その結果、Homologous Recombination （HR） 経路選択性が低下している可能性が示唆されつつある。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当該研究一年目の計画に従い、＜染色体不安定性の定量と定性＞を行い、USP10-KO MEFではgH2AX foci 形成、comet assayによる染色体不安定化の定量を実施し、自発的DNA損傷が頻発していることを確認した。またCRISPR-cas9 でUSP10 をノックアウトしたヒト癌細胞においても同様の結果が得られた。またDNA損傷誘導後の経過を観察することでUSP10-KO細胞はDNA損傷修復が遷延化することが示唆された。またUSP10-KO 細胞は様々なDNA損傷誘導剤へ感受性を示した。
上記したDDR異常をきたす分子機構を明らかにするため、＜USP10-KO細胞におけるDDR 関連蛋白質の解析＞を実施した。ATM、ATR阻害剤ではWT、KO間のgH2AX foci 形成に差は認められなかった。一方で、DNA-PKcs阻害剤存在下では、USP10-KO細胞でのみDNA-PKcs阻害剤なしと同等のgH2AX foci 形成を示した。これは、USP10-KO細胞ではDNA-PKcs活性が亢進している、もしくはDNA-PKcsによるATMの活性化が必要としなくなっている可能性が示唆された。
そこで、NHEJ 活性を評価するため、NHEJ 経路修復を引き起こすEtoposide によるgH2AX foci 形成を検出した。その結果、gH2AX foci 形成増加、遷延化は解消した。次に、HR 経路を評価するためにSister chromatid exchange 法を用いて、HR経路誘導剤であるCamptothecinを加え、染色体間組み替え率を解析すると、USP10-KO ではHR の効率が有意に抑制されていた。以上の結果から、USP10-KOではDNA-PKcsの活性が優位となることでDNA複製時のHR 経路選択に干渉していることが示唆された。
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| Strategy for Future Research Activity |
当該研究一年目に、計画していたDDR 経路の異常の分子メカニズムの一端を担う分子としてDNA-PKcsが新規候補分子として見出した。DNA-PKcs の欠失は免疫不全マウス（scid mouse）の作成として広く知られているが、そのリン酸化部位の変異マウスはUSP10と極めて酷似したHSCの減少を伴う貧血を呈することが報告されている。そこで今後は、DNA-PKcsを制御する翻訳後修飾と、DNA-PKcsによるリン酸化蛋白質について解析していく。またATMとDNA-PKcsはお互いにリン酸化することから、そのクロストークについても解析する。
NHEJ/HR経路選択性が変化するだけでは、DNA修復がなされないことの説明はできない。またNHEJを誘導するEtoposide処理ではこのような遷延化は生じない。すなわち、HR 経路で修復されるべきDNA 損傷部位にHR及びNHEJ 関連蛋白質が蓄積することでお互いの経路を阻害している可能性が考えられた。しかし、NHEJ factorは切断部位に１分子で働くため、一般的な蛍光抗体法ではNHEJ factor のfoci を検出した例はなく、超解像度顕微鏡を必要とする。そのため、この仮説を立証するためには共同研究の開拓、もしくは新規方法を樹立する必要がある。
その他、USP10コンディショナルノックアウトのためのERT2Cre 発現マウスは、タモキシフェンの経口投与によるCre-loxPの実験系の効率が極めて低かったため、別のCre発現マウスを用いた実験系を再構築する必要がある。
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| Causes of Carryover |
平成30年度は使用予定額の99%を使用した。大きな変更はなく、繰越し金は研究計画に則って使用する。
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Research Products
(1 results)
