2018 Fiscal Year Research-status Report
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18K06071
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
白井 温子 国立研究開発法人理化学研究所, 開拓研究本部, 研究員 (60525575)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
中山 学 公益財団法人かずさDNA研究所, 先端研究開発部, 主任研究員 (30370927)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | ヘテロクロマチン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ヘテロクロマチンは、遺伝子発現調節や染色体の維持などを介して、様々な生命現象に重要な役割を果たす高次クロマチン構造である。しかしその形成の仕組みの詳細は、動物細胞では未だ謎に包まれている。申請者は、Suv39h1によるヘテロクロマチン形成にその領域のnoncoding RNA (ncRNA) が重要な役割を果たす事を明らかにしたが、機能の詳細は不明である。本研究では、1)代表的なヘテロクロマチンであるペリセントロメア領域を構成するmajor satellite配列を異所的に挿入し、この配列から転写されるncRNAに依存して新たなヘテロクロマチンが形成されるかどうかを検討し、2)ncRNAが持つヘテロクロマチン形成における役割の解明を目的にしている。本年度では、まずmajor satellite DNAのクローニングを行い、10 kbpの長鎖のmajor satellite DNAを作製した。さらに、ヘテロクロマチン形成を簡便にモニタリング出来るように、上流にGFPを挿入したベクターを作製した。そして、研究分担者の中山ら（かずさDNA研）が開発した高頻度で部位特異的組換え反応を起こせる酵素システム (VloxP-SloxPシステム)を用いて、上流にGFPを付加したalphoid DNA 7.5 kbpやmajor satellite配列 10 kbpをHEK293細胞のAAVS領域に挿入した株の構築に成功した。今後、異所的に挿入した繰り返し配列から転写されるncRNAに依存してヘテロクロマチンが形成されるか検討し、ncRNAが持つヘテロクロマチン形成における役割の解析を詳細に進めたい。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
10 kbpの長鎖のmajor satellite DNAを作製し、実際に細胞に異所的に挿入された株を作製できたため。
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| Strategy for Future Research Activity |
今年度では、異所的にmajor satellite DNAを挿入した細胞株を作製でき、異所的にmajor satellite DNAを挿入する手法を確立できた。次年度では、ChIP解析によって挿入した繰り返し配列のサイレンシング状態を検討し、異所的ヘテロクロマチンが形成される長さを検討し、この配列から転写されるncRNAに依存して新たなヘテロクロマチンが形成されるかどうかを検討していきたい。
また、VloxP-SloxPシステムが機能するマウス細胞をH3K9me3の局在を顕微鏡で観察しやすいマウス胎児線維芽細胞（MEF）細胞で作製しようと思っていたが、当初の予想よりもVloxP-SloxPシステムの組換え頻度が低いことから、細胞への外来DNAの導入効率が低く、組換え効率の低いMEF細胞ではなく組換え効率の高いES細胞でVloxP-SloxPシステムが機能する株を構築する予定である。
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