2018 Fiscal Year Research-status Report
GCN5のPCAF-HDが担う肝糖新生亢進機構の立体構造からの解明
| Project/Area Number |
18K06077
|
|---|
| Research Institution | Nara Institute of Science and Technology |
|---|
Principal Investigator |
深井 祥子 (藤間祥子) 奈良先端科学技術大学院大学, 先端科学技術研究科, 准教授 (40363535)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
|
| Keywords | Ｘ線結晶構造解析 / ポリユビキチン化反応 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、GCN5のE3活性および糖新生亢進との関係の解明を目的としている。初年度である平成30年度は、６つの研究計画のうち、①E2酵素の選別、③ Znフィンガー構造の活性における役割の解明、の２つの実験を行った。
それぞれの結果の概要を記す。
<①E2酵素の選別> 実験計画通り、市販のE2酵素10種類を用い、GCN5の自己ユビキチン化に用いられるE2酵素を選別した。結果、UbcH3, UbcH5a, UbcH5b, UbcH5cにおいて明確なポリユビキチン化反応を確認した。UbcH5a, ５b、５cはアミノ酸配列相同性が高く、同様のポリユビキチン化反応パターンを示したため、同様の機構で働くと判断し、次からの実験からは、UbcH5bを用いることにした。次に、UbcH3遺伝子を理化学研究所より購入し、UbcH5bと同様に大腸菌発現系を用いて高純度精製標品を調製した。独自に調製した高純度の２種類のE2酵素を用いて、ポリユビキチン化反応を評価した。結果、UbcH5bがより効率高くGCN５の自己ユビキチン化反応を進めることを見出した。
<③ Znフィンガー構造の活性における役割の解明> 結晶構造からGCN5は特徴的な2核配位のZnフィンガーモチーフを持つことを明らかにしていた。Znに配位する７つの配位残基の前半と後半をアラニンに置換した２種類のアラニン変異体を作成した。同時に、立体構造から同定したZnドメインを欠損させた欠損変異体も作成した。これらをそれぞれ大腸菌で発現させ、自己ユビキチン化活性を測定した。結果、Zn配位はGCN5の安定化に寄与すること、Znドメインを欠損させることによりユビキチン化反応がほぼ消失することを見出した。
以上の結果と先行研究で行った結晶構造解析の結果を合わせて、論文を執筆した。現在、投稿準備中である。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
計画研究で掲げた６つの計画のうち1/3に当たる2つを終えることができた。
E2酵素の選別、およびZnフィンガードメインの変異体実験では、E2酵素の持つポリユビキチン化反応に由来するバックグランドの高さから最適な活性測定系の確立に時間を要したが、最終的には測定系の確立に成功した。
上記実験が終了したのちに、研究代表者の所属変更があり後半は実験が思うように行えなかったが、論文執筆を行うなど研究活動は順調に前進した。
|
| Strategy for Future Research Activity |
現所属において、研究を推進する環境は整っている。新たに大学院生に研究協力者として参画してもらう計画でおり、研究をより精力的に進めてゆく。
本年度は残る計画のうち、②活性ドメイン、活性残基の同定および⑥Ub転移機構の立体構造からの解明を中心に行う。また、⑤PKAによるリン酸化とUb転移機構の評価実験も開始する。
|
