2020 Fiscal Year Research-status Report
GCN5のPCAF-HDが担う肝糖新生亢進機構の立体構造からの解明
| Project/Area Number |
18K06077
|
|---|
| Research Institution | Nara Institute of Science and Technology |
|---|
Principal Investigator |
深井 祥子 (藤間祥子) 奈良先端科学技術大学院大学, 先端科学技術研究科, 准教授 (40363535)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2022-03-31
|
| Keywords | 構造生物学 / 結晶構造解析 / ユビキチンリガーゼ |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、２型糖尿病治療薬開発に向け、肝糖新生酵素遺伝子の発現機構を構造生物学的アプローチからの解明を目的とする。特に、GCN5蛋白質のN末端ドメインが持つユビキチンリガーゼ(E3)活性に着目し、新規E3酵素の活性発揮機構の解明を第一の目的とし研究を進めている。
R２年度は、R１年度に引き続き、試験管内でのユビキチン化酵素活性を評価するための実験系の確立を試みた。これは、研究計画の②『活性ドメイン、活性残基の同定』、⑥『E2酵素, UBの認識UB転移機構の立体構造からの解明』に該当する。R１年度では、市販のE１酵素、ユビキチンを用いて、GCN5全長およびGCN５のPCAF-HDによるE2酵素からユビキチンを転移する能力が有るかを評価したが、弱い活性しか確認出来ず、また再現性においても課題があった。検討した結果、使用したユビキチンの購入ロットにより活性に差が出ることが明らかとなり、E１酵素、ユビキチンを自作し、既報に従い高純度精製し活性測定を行うことにした。結果、安定に酵素活性が確認できるようになった。また、GST融合PCAF-HDを用いて、PCAF-HDは付加タグGSTに効率良くユビキチン転移反応を触媒することも明らかになり、研究代表者らが決定したPCAF-HDが新規フォールドを持つユビキチンE３酵素であることが明確になった。構造を基盤とし、PCAF-HDの特徴的なZnフィンガー領域を欠損させ活性を測定した結果、Znフィンガー領域が活性に関与することが明らかになった。このZnフィンガー構造は典型的なユビキチンE３酵素が持つRINGドメイン構造とは明確に構造が異なる。このZnフィンガー領域単独では、E３酵素活性が確認されなかったが、精製標品に分解も見られたため、再度調製方法を検討し、丁寧に検証していく必要がある。以上の結果をまとめて、論文を発表した。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
今年度の課題であったin vitroでの活性測定系の確立に成功し、複合体構造研究に向けた実験に着手する準備が整った、それぞれの高純度試料調製方法の確立は完了したので、結晶化に実験研究を進める。
|
| Strategy for Future Research Activity |
初年度の実験は順調に進んだが次年度（R１年度）の実験計画が当初の予定より進捗しなかった。3年目のR２年度にR１年度の課題を克服できたので、全計画の1/2程度が達成できたことになる。補助事業期間の延長をしたので、R２年度に構築したin vitroでの活性評価系を用いて、GCN５のE3活性を発揮するために必要な領域の同定を行うのと並行して結晶構造解析に向けた構造のスクリーニング実験を積極的に行う。
|
| Causes of Carryover |
COVID-19感染拡大による登校制限で実験が計画通りに進まなかったこと、全ての参加学会がオンラインとなり学会参加費が大幅に削減できたため未使用額が生じた。最後まで達成できていない計画研究を進めるための経費として使用する。具体的には、追加実験の実施や学会参加、論文投稿準備に利用する。
|
