2019 Fiscal Year Research-status Report
三者複合体形成型ABC輸送体MacBによる基質輸送機構の解明
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18K06079
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| Research Institution | Tokyo Institute of Technology |
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Principal Investigator |
岡田 有意 東京工業大学, 生命理工学院, 助教 (20507181)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 膜輸送体 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、ATPの加水分解エネルギーを利用して基質を能動輸送するATP-binding cassette（ABC）輸送体のうち、外膜チャネルと膜融合蛋白質と複合体を形成して基質の輸送を行う三者複合体形成型輸送体MacBについて、その基質輸送機構を解明することを目的としている。この輸送体MacBは、マクロライド系抗生物質やペプチド毒素、リポ多糖、プロトポルフィリン等を輸送する重要な研究対象である。これまでにMacB単独の結晶構造を明らかにしてきたが、その基質輸送機構の詳細な解明には、輸送基質とMacBの複合体の立体構造情報が不可欠である。2018年度に、MacBとの複合体の結晶化条件の探索実験に利用可能な、高濃度かつ高純度の基質の調製に成功した。また、MacBと基質の相互作用を確認する実験系の確立も行った。そこで2019年度は、その基質、実験系を用いて、MacBとの相互作用の確認実験を行った。調製した基質およびMacBが、ある条件下で相互作用することを確認した。その基質-MacB複合体を用いて、結晶化条件の探索を行った。その結果、複数の条件下で結晶が得られ、より高い分解能で解析が行える回折データが得られるように、それぞれ結晶化条件の最適化を行った。さらに、X線回折実験にあたって必要な、抗凍結処理の条件の検討も行った。今後、さらに良質なデータを得るために、それらの実験条件の最適化を行い、MacBの基質輸送機構を詳細に理解するため、基質-MacB複合体の構造解析を目指す。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
MacBと基質の複合体の構造解析を目指し、調製した基質とMacBの相互作用を確認した。さらに、その複合体を用いて、結晶化条件の探索を行い、いくつかの条件で結晶が得られた。X線結晶構造解析では、X線照射による結晶へのダメージを軽減するために、窒素ガス気流中の低温条件下で回折実験を行うが、そのためには、蛋白質の結晶に抗凍結処理をする必要がある。本研究においても、MacB-基質複合体の結晶の抗凍結処理の条件の検討を行った。大型放射光施設SPring-8のビームラインにて、それらの結晶を用いた回折実験を行ったところ、およそ3オングストローム分解能のデータを得た。今後、さらに高分解能での構造解析を目指して、結晶化条件、抗凍結処理の条件等を最適化していく。X線回折実験に使用可能な蛋白質結晶が得られており、おおむね順調に進捗しているといえる。
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| Strategy for Future Research Activity |
基質-MacB複合体の構造解析に向けて、結晶化条件、抗凍結処理の条件等を最適化していく。またそれと並行して、加水分解されないATPアナログ等を用いて、構造変化が予想されるヌクレオチド結合型の構造解析も目指して、試料調製・結晶化条件の検討を行う。さらに必要に応じて、他の生物種由来のMacBホモログについても、調製の条件検討を行い、基質-MacB複合体やヌクレオチド結合型の結晶構造解析を目指す。
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| Causes of Carryover |
おおよそ、予定通りに試料の調製実験、結晶化条件の探索実験を行うことができたため、物品費は予定通りに使用した。一方、旅費について、当初は、大型放射光施設SPring-8（兵庫県）での回折実験は、研究代表者が直接現地に行くことを想定していたが、結晶を放射光施設に送付し、共同研究者に測定を代行してもらい使用しなかったために残額が生じた。2020年度は、より多くの条件で、試料調製、結晶化を試みる予定のため、それに関連する試薬、消耗品を購入する物品費として使用する予定である。
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Research Products
(1 results)
