2019 Fiscal Year Research-status Report
真核生物停滞リボソーム上におけるぺプチジルtRNA分解のメカニズム解明
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18K06080
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| Research Institution | Niigata University |
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Principal Investigator |
伊東 孝祐 新潟大学, 自然科学系, 准教授 (20502397)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
西川 周一 新潟大学, 自然科学系, 教授 (10252222)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 翻訳 / ペプチジルtRNA / ユビキチン化タンパク質運搬因子 / 分子遺伝学的解析 / X線結晶構造解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
生体内では様々な要因で翻訳は異常停止し、合成途中の未成熟ペプチドがtRNAに結合したままのぺプチジルtRNAが停滞リボソーム内に産生される。このような状態は細胞にとって有害であり、翻訳の品質管理機構によって解消されなければならない。現在までの研究により、ペプチド部位が短鎖の場合、ぺプチジルtRNAはリボソームから細胞質に放出され、そしてぺプチジルtRNA加水分解酵素 (Pth) によりペプチドとtRNAに分解されて翻訳停滞が解消されることがわかっている。一方、ペプチド部位が長鎖の場合、ぺプチジルtRNAは停滞リボソーム上でペプチドとtRNAに分解されることが知られているが、この反応を担う因子は真核生物では未だ不明である。一方、我々は最近、Pthがユビキチン化タンパク質運搬因子と直接相互作用することを見い出している。本研究の目的は以下の通りである。
1) 長鎖ぺプチジルtRNAを停滞リボソーム上で分解する因子を分子遺伝学的手法で探索する。
2) Pth-ユビキチン化タンパク質運搬因子の相互作用様式をX線結晶構造解析で明らかにする。
3) Pthとユビキチン化タンパク質運搬因子が共同でリボソーム上の長鎖ぺプチジルtRNAの分解に働いている可能性を追究する。
研究成果であるが、1)については、今年度は長鎖ぺプチジルtRNAを停滞リボソーム上で分解する因子の候補の遺伝子破壊株を作製した。そして、それら破壊株中で長鎖ぺプチジルtRNAを発現させる実験を行い、野生株との違いを比較検討した。2)については、ほぼ構造解析が終了している。3)については、2)の構造解析の結果をもとに、ユビキチン化タンパク質運搬因子と相互作用しないPthを設計し、in vitro実験において実際に相互作用が無くなったことを確認するところまで終了した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究の課題は大まかに以下の3つであり、それぞれについての進捗状況を以下に記す。
課題1)である「長鎖ぺプチジルtRNAを停滞リボソーム上で分解する因子を分子遺伝学的手法で探索する。」については、当初の予定通り、長鎖ぺプチジルtRNAを停滞リボソーム上で分解する候補因子の遺伝子破壊株を作製することができた。また、それらの株で長鎖ぺプチジルtRNAを発現させる実験も行った。
課題2)である「Pth-ユビキチン化タンパク質運搬因子の相互作用様式をX線結晶構造解析で明らかにする。」に関しては、当初の予定通り構造解析がほぼ終了した。
課題3)である「Pthとユビキチン化タンパク質運搬因子が共同でリボソーム上での長鎖ぺプチジルtRNAの分解に働いている可能性を追究する」については、当初の予定通り、課題2)の結果をもとにユビキチン化タンパク質運搬因子と相互作用しないPthを設計し、in vitro実験において相互作用が無くなることを確認するところまで終了した。
以上の結果を勘案し、「おおむね順調に進展している」と判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
課題1)の「長鎖ぺプチジルtRNAを停滞リボソーム上で分解する因子を分子遺伝学的手法で探索する。」については、長鎖ぺプチジルtRNAを停滞リボソーム上で分解する候補因子の遺伝子破壊株において長鎖ぺプチジルtRNAを発現させる。そして、それら株の生育状態を分析する実験を行う。また、Nu-PAGEや停滞リボソームの精製により、長鎖ぺプチジルtRNAの分解状態を分析する。
課題2)の「Pth-ユビキチン化タンパク質運搬因子の相互作用様式をX線結晶構造解析で明らかにする。」に関しては、精密化計算を行い最終構造を決定する。
課題3)の「Pthとユビキチン化タンパク質運搬因子が共同でリボソーム上での長鎖ぺプチジルtRNAの分解に働いている可能性を追究する」については、ユビキチン化タンパク質運搬因子と相互作用しないPthを発現する株を作製し、その株において長鎖ペプチジルtRNAを発現させる。そして、長鎖ぺプチジルtRNAを停滞リボソーム上で分解することにPthおよびユビキチン化タンパク質運搬因子が関与するかを、株の表現型や株中のペプチジルtRNAの分解状態を分析することで精査する。
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| Causes of Carryover |
予想よりもスクリーニングが少なく実験結果が得られたところもあったため。その分を来年度、主に課題3)の実験費用に充てる。
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