2018 Fiscal Year Research-status Report
Visual Analyses of Long Single-stranded RNA Genome
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18K06082
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
竹安 邦夫 京都大学, 生命科学研究科, 研究員 (40135695)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 長い一本鎖RNAの高次構造解析 / HCVゲノムRNAの高次構造 / 原子間力現鼻鏡法（AFM) / RNAゲノムフォールディング |
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| Outline of Annual Research Achievements |
数kbにおよぶ長い一本鎖RNAの構造解析は容易ではない。より長い、ウィルスゲノムのような一本鎖RNAの全長の二次構造を一気に解析することは、現在でも不可能である。本研究では、原子間力顕微鏡法（Atomic Force Microscopy; AFM）を活用し、二次構造未知のウィルスゲノムRNAの‘まるごと’から見た構造解析に挑戦する。さらに、ゲノムRNAのフォールディングのメカニズムを明らかにする。本年度（初年度）は、HCVウィルスゲノムRNA（~9 kb）をモデル材料とし、ゲノムの高次構造（二次構造）を‘まるごと’から見たAFM画像の取得・解析に打ち込んだ。
まず、T7-プロモーター下に組み込んだcDNAを転写して、ゲノムRNAを得た。5’近傍、3’近傍の部分構造は既知であるので、中央部のコーディング領域を欠損したDeletion Mutant と全長のAFM画像と比較したところ、3’のポリU（直線部分）、5’の領域等、特徴的な構造が両者に見られた。これらの画像をMATLAB-base のプログラムを用いて解析した。
ゲノム中央の大部分（～8kb）の構造は全く未知であり、ここに、HCVゲノムRNA全長の画像解析を行う意義がある。現在のところ、非常に類似した画像が20枚程度繰り返し得られた。これまでに成功した28S rRNAを例としたAFMによる可視化、画像解析法を利用し、独自のMATLAB-base のプログラムを用いて、Main Chain（主鎖）の検出、Main Chain を直線的に表した場合の各Domain の塩基数の解析を現在おこなっている。
以上の途中経過を、連携研究者（国立衛生研究所所長 脇田隆字博士）のグループと共著で、米国生物物 理学会（2019年2月5日、Baltimore）において発表した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
すこし遅れ気味ではるが、まあ順調に進展していると判断している。
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HCV ゲノムRNA は28ＳrRNA のおよそ2倍の長さであるため、既知の５‘‐領域、３’‐領域以外の中央部（約８kb）には、構造未知の大小30近い二次構造（ワトソン‐クリック様の二重らせん）が見られる。この部分の塩基長を推定・決定するには予想以上に多大な労力と時間を要することが分かった。
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| Strategy for Future Research Activity |
次年度では、HCV ゲノムRNA全長のMain Chainの決定と各Domainの塩基長の割り出しを急ぎ、ゲノムRNAの構造モデルを提出したい。
進捗状況に応じて、ゲノム全長および Deletion Mutant と Capsid タンパク質との相互作用を可視化解析する。
技術的問題として、HCV ゲノムRNAの全長（約９kb）をＴ7プロモーター下の転写で得ることが難しいことが挙げられる。この点の克服が急がれる。
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| Causes of Carryover |
本年度は、研究上は一応順調に進んだので、少額の残高は次年度で有効に活用たいと考えた。
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