2019 Fiscal Year Research-status Report
Visual Analyses of Long Single-stranded RNA Genome
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18K06082
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
竹安 邦夫 京都大学, 生命科学研究科, 研究員 (40135695)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 長い一本鎖RNAの高次構造解析 / HCVゲノムRNAの高次構造 / 原子間力現鼻鏡法（AFM) / RNAゲノムフォールディング |
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| Outline of Annual Research Achievements |
数Kbにおよぶ長い一本鎖RNAの構造解析は容易ではない。最近明らかになった「28ｓリボソームRNAの二次構造」の解明には２０余年を要した。より長い、ウィルスゲノムのような一本鎖RNAの全長の二次構造を一気に解析することは、現在でもス可能である。本研究者は、これまでに、原子間力顕微鏡法（Atomic Force Microscopy: AFM）を用いて、28s rRNA（~４Kb）の二次構造を〝まるごと“一気に解析する技術を開発した。
本研究では、AFMを活用し、二次構造未知のHCVウィルスゲノムRNA（~9 Kb）の〝まるごと”から見た構造解析に挑戦し、ゲノムRNAのフォールディングのメカニズムを明らかにする。
昨年度（初年度）は、T7プロモーター下に組み込んだcDNAを転写して得られたゲノムRNA（全長、5'近傍、３‘近傍、コーディング領域の欠損RNA）のAFM画像をMATLAB-base のプログラムを用いて解析した。5'近傍および３‘近傍の構造は文献的に明らかになっている部分構造と一致した。これらの部分領域構造は、全長構造を決定する際の方向性の指標となった。以上の結果を、連携研究者（国立衛生研究所所長 脇田隆字 博士）グループと共著で、米国生物物理学会（2019年２月5日、Baltimore、USA）において発表した。
本年度（次年度）は、これまでにHCVゲノム全長のAFM画像から、Main Chain（主鎖）の抽出、Main Chain上に検出された各Domain の塩基数の推定を行い、論文執筆に向けて二次構造を決定中である。また、研究協力者（Univ. Cambridge、Henderson 博士）との共同で、DNA-Origami上に一本鎖RNAの5'-あるいは３‘-末端を結合させ、液中高速AFMを用いて各Domain間の相互作用を解析する手法の開発に着手した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
通常のAFM（大気中）を用いて、各種ゲノムRNAとCapsidタンパク質との相互作用の画像を取得したが、静止画像であること。全体構造が大きく複雑すぎること、等のことから、解析が困難であった。
そこで、「ゲノムRNAの液中での動態を理解した上で、タンパク質との相互作用を調べたほうが合理的であろう」とのことから、まず、液中高速AFMを用いることにした。
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| Strategy for Future Research Activity |
来年度（最終年度）中には、HCVゲノムの二次構造を確定し、論文発表にこぎつけたい。また、長い一本鎖RNAの液中での動態を液中高速AFMで明らかにしたい。
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| Causes of Carryover |
本年度三月に予定していた海外出張が、新型コロナウィルスのため、来年度に延期された。
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