2018 Fiscal Year Research-status Report
べん毛モーター固定子複合体の高分解能構造解析による回転メカニズムの解明
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18K06085
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
寺原 直矢 大阪大学, 生命機能研究科, 特任助教(常勤) (40554738)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | クライオ電子顕微鏡 / 単粒子解析 / 高速AFM / 1分子解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
細菌のべん毛モーターは、人工のモーターと非常によく似ており、固定子と回転子からなる回転モーターとして機能する超分子複合体である。陽イオンチャネルとして機能する固定子の内部に陽イオンが流れると、固定子と回転子が相互作用し、その結果回転力が発生すると考えられている。この回転力を生み出す際に、陽イオンの流れに共役して固定子のダイナミックな構造変化が起こることが推察されているが、固定子の立体構造が明らかにされていないためその詳細は不明である。したがって、べん毛モーターの回転メカニズムを解明するためには、固定子の高分解能立体構造およびその動的構造変化を解析することが必要不可欠である。本研究では、クライオ電子顕微鏡および高速原子間力顕微鏡を用いて、単離精製した固定子複合体の立体構造およびその動的構造変化を高分解能で明らかにすることを目的とする。
固定子として機能する膜タンパク質MotPS複合体は界面活性剤存在下で、単分散した状態で精製することに成功した。そこで、そのサンプルを用いてクライオ電子顕微鏡観察用の氷包埋試料を作製し観察したところ、単分散していたサンプルが大きな凝集体を作った。これは、氷包埋時の物理的影響によるものと考えられた。そこで、氷包埋時の条件を検討したが、劇的な改善には至らなかった。一方、同じ精製サンプルを高速原子間力顕微鏡でも観察を行った。MotPS複合体のマイカ基板上における配向を制御するため、ヒスチジンタグを利用した。しかし、MotPS複合体の膜貫通領域がマイカ表面と非常に強い相互作用を有するためか、様々な方向を向いて観察され、配向の制御には至っていない。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
現在まで、クライオ電子顕微鏡観察用の氷包埋試料作製条件の検討を行ってきたが、単分散した状態のままでの氷包埋試料の作製に成功していない。また、高速原子間力顕微鏡観察でも様々な観察条件を検討してきたが、配向の制御に成功していない。そのため、やや遅れていると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
クライオ電子顕微鏡観察では、氷包埋試料作製条件の検討ではなく、サンプルの状態を検討する。現在までは、界面活性剤存在下のサンプルを用いていたが、界面活性剤の代わりに両親媒性高分子であるAmphipols A8-35に置き換えたサンプルを作製する。この操作の際、バイオビーズによって界面活性剤を除去するため、界面活性剤を一切含まない。したがって、一般的な可溶性タンパク質と同様な扱いが可能であり、氷包埋試料を改善することができると期待される。一方、高速原子間力顕微鏡観察では、サンプルの膜貫通領域がマイカ表面と非常に強い相互作用を有すると考えられることから、あらかじめ脂質膜に再構成した状態、 特に2次元結晶を作製し、配向の揃った状態での高分解能の観察を目指す。
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| Causes of Carryover |
高速AFM実験のための金沢大学への出張が少なく、また海外における学会参加を行わなかったため。
次年度は膜タンパク質の再構成実験を行うため、特に界面活性剤や脂質の購入に使用する予定である。また、引き続き金沢大学への出張も予定している。
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| Remarks |
[報道]寺原直矢、南野徹、難波啓一 academist Journal2018年4月2日 寺原直矢、南野徹、難波啓一 北國新聞2018年4月26日 寺原直矢、井上由美、南野徹、難波啓一、今田勝巳 日本経済新聞電子版2018年4月26日 寺原直矢、井上由美、難波啓一、南野徹 日経バイオテクONLINE2018年5月1日 加藤貴之、牧野文信、寺原直矢、難波啓一 日経バイオテク2019年2月25日
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