2018 Fiscal Year Research-status Report
クライオ電子顕微鏡によるオカザキソームの機能構造連関の研究
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18K06089
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
真柳 浩太 九州大学, 生体防御医学研究所, 助教 (50418571)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
石野 良純 九州大学, 農学研究院, 教授 (30346837)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | クライオ電子顕微鏡 / DNA複製 / 立体構造解析 / 超分子複合体 / 生物物理 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
Lig-FEN-PCNA-DNA複合体については、tilt validation法等の補足データの取得及び解析を行い、論文に記載の立体構造の信頼性を向上させた。その結果、FEN-PCNA-DNA複合体及びFEN-Lig－PCNA複合体の解析結果が論文に掲載された(Mayanagi et al., Scientific Reports, 2018)。本論文は異なる複製因子FENからLigの間でDNAの受け渡しが行われる瞬間を初めて捉えたものである。PolD-PCNA-DNA複合体に関しては先ずPolD単独の電子顕微鏡解析より着手した。PolD はDP1及びDP2のサブユニットから構成され、各サブユニットの部分構造の結晶構造が得られているものの、全体構造はおろか、サブユニットの構成比も未知であった。 PolD単独の単粒子解析を行い、二次元平均像が得られた。この結果を元にDP1とDP2のサブユニット構成及びその相対的配置を明らかにすることができた。これらの構造データはExtremophile（Takashima et al., 2018）に掲載された。PolD-PCNA-DNA複合体は所属研究所のクライオ電子顕微鏡において最適凍結条件の探索、初期立体構造解析を行ったのち、最先端の検出器を装備したクライオ電顕（大阪大学・タンパク質研究所）にて高分解能動画データを記録した。本複合体はA型及びB型の２つの構造が確認されていたが、より高分解能の構造が出ていたA型の構造に関して、更に分解能が向上した。興味深いことに、新たに採用した精製・凍結条件においては、３次元クラス分け解析においてB型の構造が存在していない。A型B型共に結晶構造の当てはめ、類似構造を用いたモデリングにより複合体の原子モデルの構築を行い、現在論文を準備中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
FEN-Lig-PCNA-DNA及びFEN-PCNA-DNAの構造解析、複製因子切り替え機構に関する論文が掲載された。PolD単独の解析結果についても論文にて発表を行った。PolD-PCNA-DNAの解析に関しては現在論文執筆中である。同複合体に関しては分解能も順調に向上しており、概ね順調に進行している。
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| Strategy for Future Research Activity |
引き続き最先端クライオ電子顕微鏡観察技術、画像解析・構造解析法を用いることで、高分解能化を目指す。またPCNAと他の因子との複合体の精製を行い、凍結条件の検討、クライオ電顕による単粒子解析を試みる。
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| Causes of Carryover |
年度途中で予想以上に測定及び解析が進行し、必要なHDD及び試薬が予定より増加、前倒しを申請した。そのため次年度使用額が生じた。
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[Presentation] Replisome structure and its functions in Archaea2018
Author(s)
Yoshizumi Ishino, Keisuke Oki, Mariko Nagata, Kouta Mayanagi, Tsuyoshi Shirai, Takuji Oyama, Kosuke Morikawa, Takeshi Yamagami, and Sonoko Ishino
Organizer
OKAZAKI Fragment Memorial Symposium: Celebrating the 50th anniversary of the discontinuous DNA replication model
Int'l Joint Research / Invited
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