がん抑制に関わる選択的スプライシング制御蛋白質の標的遺伝子の同定と認識機構の解明

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K06093
• Research Institution: Musashino University
• Principal Investigator: 桑迫 香奈子 武蔵野大学, 薬学部, 講師 (10568736)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 井上 裕介 群馬大学, 大学院理工学府, 准教授 (90304302)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: mRNAスプライシング / 結晶化

Outline of Annual Research Achievements

特定のスプライシング制御蛋白質が，アポトーシス誘導に関わる遺伝子の選択的スプライシングを制御することで，がん化の抑制に寄与すると考えられている。しかし，実際に，この蛋白質が選択的スプライシングを制御する遺伝子の数や種類，標的配列とその認識機構は未知である。そこで，本研究では機能・構造解析によって，この蛋白質によるスプライシング制御メカニズムを明らかにすることを目的とする。
この蛋白質にはN末端側にRNA結合ドメインが3つあり，この部分が協動的にRNA結合を担っていると考えられる。そこで，この部分の蛋白質（以下トリプルドメイン）と標的配列を含むRNA断片との共結晶の作製を試みた。まず，トリプルドメインの調製を行った。無細胞タンパク質合成系に界面活性剤を添加することで，トリプルドメインの大半を可溶性画分に合成することができた。これを，あらかじめ付加しておいたタグによるアフィニティークロマトグラフィー，タグの切断，ゲルろ過クロマトグラフィーの順に精製した。標的配列を含むRNA断片と混合し，結晶化スクリーニングを行ったところ，いくつかの条件で微結晶が得られた。一方，大腸菌にプラスミドベクターを導入してトリプルドメインを大量発現させる方法では，精製後の試料において，トリプルドメイン以外に，わずかに大腸菌由来のRNaseが混在してしまう点がすでに問題となっていた。そこで，あらかじめ2種類のタグを付加しておき，2種類のアフィニティークロマトグラフィーを行った後にタグを切断して，さらにゲルろ過クロマトグラフィーを行った。この試料も同様に結晶化スクリーニングを行ったところ，いくつかの条件で微結晶が得られた。これらの結果，結晶化に成功する共通の条件が明らかとなった。今後は，再現性を確認した後，構造解析に適した結晶が得られるように条件をさらに検討していく。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

微結晶を得られたが，立体構造解析に適した結晶を得るために，さらなるスクリーニングが必要である。しかし，このトリプルドメインは，塩濃度を下げると沈殿してしまうため，扱いが難しく，収量が低い。今後，改善する必要があると考える。

Strategy for Future Research Activity

トリプルドメインは，精製過程において，あらかじめ付加しておいたタグを切断した後に沈殿しやすくなると考えられる。そこで，タグを切断する前に，標的配列を含むRNA断片と混合して複合体とし，それからタグを切断してゲルろ過クロマトグラフィーを行う予定である。

Causes of Carryover

本年度に，立体構造解析に適した結晶を作製するための試薬等を購入する予定であったが，まだ，1次スクリーニングの段階である。1次スクリーニングにおいて，いくつかの条件で微結晶が得られているため，これらの試薬等は，次年度に購入予定である。