Crystal structure analysis of multi-subunit IFT-B core complex involved in ciliogenesis

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K06099
• Research Institution: High Energy Accelerator Research Organization
• Principal Investigator: 川崎 政人 大学共同利用機関法人高エネルギー加速器研究機構, 物質構造科学研究所, 准教授 (00342600)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: 繊毛内輸送 / 多サブユニット複合体 / 結晶構造解析

Outline of Annual Research Achievements

繊毛内輸送を司るIFT（intraflagellar transport）装置は、6サブユニットのIFT-A複合体（760 kDa）と16サブユニットのIFT-B複合体（1,000 kDa）、8サブユニットのBBSome（490 kDa）から構成される。IFT-B複合体はキネシン2と結合することで繊毛内の軸糸微小管に沿った順行輸送を担う。IFT-B複合体は10サブユニットのコア複合体と6サブユニットのペリフェラル複合体から成り立っている。IFT-Bコア複合体は530kDaのタンパク質複合体であるが、それぞれ5サブユニットから成るコア1とコア2に大きく分割される。本年度はヒトのIFT-B複合体コア1について結晶化のために構造の均一化を目指して、大腸菌共発現系の改良を行った。IFT-B複合体コア1はIFT22、IFT25、IFT27、IFT74、IFT81の5サブユニットから構成される。二次構造予測に基づきIFT74サブユニットとIFT81サブユニットについてN末端およびC末端のフレキシブルと予想される領域を段階的に削除した変異体を作成した。SUMOタグを利用した多サブユニット共発現系にIFT-B複合体コア1の変異体を導入して発現量を比較した。その結果IFT74-81複合体、IFT22-74-81複合体について発現量の高いコンストラクトを得ることに成功し、大腸菌で共発現、精製し結晶化スクリーニングを行った。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

発現が極めて困難であったIFT-B複合体コア1ついて共発現領域を最適化し、結晶化に必要な量のサンプルを調製することが出来た。

Strategy for Future Research Activity

IFT-B複合体コア2はIFT46、IFT52、IFT56、IFT70、IFT88の5サブユニットから構成される。IFT-Bコア複合体2について結晶構造解析のために最適な発現領域を探索し、共発現系の改良を行う。

Causes of Carryover

本年度購入しなかった物品があるため繰越金が生じたが、翌年度は必要になるため翌年度分として請求した助成金と合わせて購入する。