2019 Fiscal Year Research-status Report
染色体ドメインを形造るグアニン四重鎖結合タンパク質Rif1の分子形態解析
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18K06102
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| Research Institution | Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science |
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Principal Investigator |
森山 賢治 公益財団法人東京都医学総合研究所, ゲノム医科学研究分野, 研究員 (00250217)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | Rif1 / オリゴマー / グアニン四重鎖 / G4 DNA / 電子顕微鏡 / 単粒子解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
マウスRif1（2,418アミノ酸）がオリゴマーを形成して複数のグアニン四重鎖DNA（G4 DNA）に結合し、そのN末端領域（NTD, 1,151アミノ酸）とC 末端領域（CTD, 299アミノ酸）も各々単独でオリゴマーとしてG4 DNAに結合することは既に報告した。当初、G4 DNAと全長Rif1オリゴマーとの複合体の微細形態をクライオ電子顕微鏡による単粒子解析で決定することを目指していた。しかし、全長Rif1の大量精製は非常に困難であったため、NTDとCTDの間にある長い天然変性領域（LID, 968アミノ酸）を欠失したRif1-NC（NTD+CTDの意）を単粒子解析することにした。トランスフェクションした293T細胞の高塩濃度抽出液から精製したRif1-NCを電顕解析担当のHuilin Li 教授に送付したところ、ネガティブ染色による電顕観察を実施された。その結果、このRif1-NC標品には不定形凝集体が多いため、凝集していないRif1-NCを大量精製して欲しいと要望された。Rif1-NTDや-CTDとは異なり、Rif1-NCは低塩濃度では細胞から抽出され難いため、これまでは高塩濃度抽出液から精製してきたが、低塩濃度抽出液から精製すれば凝集しないのではないかと期待し、低塩濃度抽出液と高塩濃度抽出液の双方からRif1-NCを大量精製した。その精製には半年を費やすこととなってしまったが、Li 教授にこの２種類のRif1-NCを送付して電顕観察を実施して頂いた。ネガティブ染色観察の結果、どちらのRif1-NCもオリゴマーのようには見えるが、正確に何量体なのかは未だ断定できず、分子形態の確定にも至らなかった。2020年1月より、クライオ電顕によるRif1-NCの単粒子解析に取り組み始めたところである。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
当初は全長Rif1オリゴマーの微細形態をクライオ電子顕微鏡による単粒子解析で決定するのが目的であり、その大量精製に最初の1年を費やしたものの、十分な精製度と量が得られなかった。この１年の時間ロスが研究の進捗が遅れた最大の要因である。全長Rif1の代わりにLID（長い天然変性領域）を欠失したRif1-NCオリゴマーを精製することに計画変更した後も、その十分な大量精製には延べ160枚もの15 cm径細胞培養皿を要し、結果半年の時間を費やしてしまった。
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| Strategy for Future Research Activity |
ネガティブ染色による電顕観察の結果、細胞の低塩濃度抽出液から精製した場合も高塩濃度抽出液から精製した場合もRif1-NCはオリゴマーのようには見えるが、正確に何量体なのかは未だ断定できず、分子形態の確定にも至らなかった。現在、Rif1-NC のクライオ電子顕微鏡による単粒子解析に取り組んでいるところであり、有益な成果を期待したい。もし、その分子形態を確定できなかった場合には、G4オリゴヌクレオチドDNAを結合させたRif1-NC の電顕観察を実施する。多くのタンパク質複合体で、リガンド結合によってその構造が安定化することが知られており、Rif1-NCの場合もG4 DNAの結合による構造安定化を期待したい。一方、全長Rif1の単粒子解析のためには、トランスフェクションする細胞での発現効率を100倍以上向上させる必要がある。そのため、Rif1の N末端側に付加するタグを発現増強効果が見込まれる種々のタグに変更して強制発現させる。また、LID内の非保存領域に短い欠失を導入してRif1発現効率の大幅向上を目指す。
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| Causes of Carryover |
「現在までの進捗状況」に記載した事情で、全長Rif1の大量精製を一旦中止したため、その発現細胞の培養やタンパク質精製に使用する筈であった研究費を次年度以降に繰越すことになった。繰越した研究費は、全長Rif1の発現効率の大幅向上とその後の精製のために使用する予定である。
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[Presentation] In search of a universal mode of DNA replication.2019
Author(s)
Masai, H., Kanoh, Y., Tanaka, T., Yoshizawa, N., Ito, S., Moriyama, K., et al.
Organizer
第42回日本分子生物学会年会 2019.12.4. 福岡国際会議場（2PW-04-4）
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