2020 Fiscal Year Annual Research Report

Electron microscopic analysis of a G4 DNA-binding protein Rif1, a key organizer of chromosomal domains

Research Project

Project/Area Number	18K06102
Research Institution	Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science
Principal Investigator	森山賢治公益財団法人東京都医学総合研究所, 基礎医科学研究分野, 研究員 (00250217)
Project Period (FY)	2018-04-01 – 2021-03-31
Keywords	Rif1 / オリゴマー / グアニン四重鎖 / G4 DNA / 電子顕微鏡 / 単粒子解析
Outline of Annual Research Achievements	G4（グアニン四重鎖）DNAと全長Rif1オリゴマーとの複合体の微細形態をクライオ電子顕微鏡による単粒子解析で決定することを目指し、マウスRif1（2,418アミノ酸）の精製に着手した。しかし、全長Rif1を大量精製することは困難であったため、そのN末端領域（NTD）とC 末端領域（CTD）の間にある長い天然変性領域（LID, 968アミノ酸）を欠失したRif1-NC（NTD+CTDの意）を解析することにした。NTDとCTDは、各々単独でオリゴマーとしてG4 DNAに結合する一方、LIDは何れにも関与しないからである。莫大な労力を費やし、Rif1-NCを発現させた293T細胞からこれを大量精製することに成功した。Huilin Li 教授のラボでこれを電顕観察したところ、不定形凝集体が多く、改善が必要となった。Rif1-NCは細胞から抽出され難いため、それまでは高塩濃度抽出液から精製してきたが、低塩濃度抽出液から精製すれば凝集し難いと期待し、低塩濃度と高塩濃度の各抽出液から再度Rif1-NCを大量精製した。Li 教授達による電顕解析の結果、どちらのRif1-NCもオリゴマーのようには見えるが、残念ながら正確に何量体なのかは断定できず、分子形態の確定にも至らなかった。そこで、マウスRif1は一旦保留し、代わりに分裂酵母のRif1（SpRif1）を大量精製することにした。SpRif1は、マウスRif1と同様にNTDとCTDにG4結合部位を持ちながら全長1,400アミノ酸と小さいからである。しかし、全長SpRif1を発現させると除去困難な分解産物が大量に蓄積してしまった。その後、N末端92アミノ酸を欠失させると分解が極度に軽減することを見出し、この欠失体（SpRif1-del-N92）の精製に成功した。以後、精製したSpRif1-del-N92の電顕解析に取り組んでいる。