2018 Fiscal Year Research-status Report
Effects of lipid envionment on the functions of sarcoplasmic reticulum calcium pump
| Project/Area Number |
18K06105
|
|---|
| Research Institution | Asahikawa Medical College |
|---|
Principal Investigator |
山崎 和生 旭川医科大学, 医学部, 講師 (60241428)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
|
| Keywords | カルシウムポンプ / イオン輸送 / ナノディスク / 静電的相互作用 / リン脂質 / 膜タンパク質 / 表面電荷 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は筋小胞体カルシウムポンプを用い膜タンパク質の機能に対する脂質環境の影響を調べるために、様々な種類、組成の脂質構成を持つナノディスクに組み込んだ標品の反応速度論的解析を行う。本年度は正電荷を持つヘッドグループを有するエチルフォスファチジルコリン（ePC）を含むナノディスクにカルシウムポンプを組み込むことを試みた。ePCのみ、あるいは中性脂質であるフォスファチジルコリン（PC）との混合脂質をを含むナノディスクを形成することはできなかったが、負電荷を持つフォスファチジルグリセロール（PG)との混合脂質を有するナノディスクにカルシウムポンプを組み込むことができた。
様々なPG/ePC比率中でのカルシウムポンプのリン酸化中間体転換速度を、イオン強度を変えて測定し、反応速度の対数の活量係数の2乗に対するプロット（速度vs活量プロット）を行って解析したところ、ePC比率の増加に伴いプロットの傾きが増加し、この反応過程を促進する静電的相互作用が増加していることが示された。このときネイティブPAGEから見積もられる膜の表面電荷と、プロットの傾きは良い相関関係を示し、負の表面電荷の増加に従いこのステップが促進されることが示されたが、以前に解析したPG/PC混合脂質の場合と比べて表面電荷の変化量に対する促進効果がPG/ePCの時の方が大きく、この反応過程に影響を及ぼす因子が表面電荷の他にも存在することが示唆された。
またカルシウムポンプ側の変異による、タンパク質―膜相互作用への影響を見積もるため、結晶構造で脂質ヘッドグループとの相互作用の存在が示唆されているArg324の変異体について解析も試みた。その結果COS-1細胞で発現させたカルシウムポンプをナノディスクに組み込み、速度論的解析、速度vs活量プロットに用いることが可能であることが示された。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
以前から用いてきた脂質に加え、新たに正電荷を持つ脂質（エチルフォスファチジルコリン、ePC）を用いた解析ができるようになり、より詳細なタンパク質ー脂質間相互作用の解析ができるようになった。またPG/ePC混合系とPG/PC混合系では表面電荷のEP転換速度へのが異なることが明らかとなり、これが脂質ヘッドグループの性質の違いによる表面電場の差がもたらすものか、あるいは脂質ヘッドグループとカルシウムポンプ間の特異的な相互作用の違いによるものなのかについて明らかにすることで、タンパク質-脂質相互作用に関する新たな知見が得られることが期待できる。
また、本年度中に発現させたカルシウムポンプをナノディスクに組み込んだ標品を作成することに成功し、その標品を用いた速度論的解析が可能であることが示された。これにより、当初計画で2019年度以降に予定している、発現させた変異型カルシウムポンプを持ちいた解析が問題なく遂行できるめど立ったため、現在のところ本研究はおおむね順調に進展していると言える。
|
| Strategy for Future Research Activity |
今後の方針として、骨格筋小胞体から調製したカルシウムポンプを用いた解析としては、まず異なる混合脂質系、PS（フォスファチジルセリン)/ePCの影響を調べるため、カルシウムポンプをこの混合脂質を持つナノディスクに組み込み、これまでと同様な反応速度論的解析を行う。また脂質混合系の違いによる膜表面電荷のEP転換ステップに対する影響の違いについて調べるために、ナノディスク全体とカルシウムポンプ近傍での脂質組成の違いに差が無いか調べてみる。以上の解析により、膜環境の影響によりポンプタンパク質がどのような影響を受けるかについて新たな知見が得られると期待される。
変異体を用いた解析では、Arg324変異体を種々の脂質組成を持つナノディスクに組み込み、反応速度論的解析と、速度vs活量プロットなどを行い膜タンパク側から脂質との相互作用の影響について探ってゆく。このさい、筋小胞体標品を用いた解析から明らかになると期待される、混合脂質系の影響を踏まえた解析を進めることで、より詳細で本質的な結論に結びつくような結果が出るよう進めてゆく。また、Arg324変異体に限らず、これまでに速度vs活量プロットに用いてきた変異体を同様な解析に用いることで、カルシウムポンプ上の位置と膜表面電荷の影響について調べていきたい。
|
| Causes of Carryover |
次年度実施予定の変異体を用いた解析のためのサンプル作りをする予定であったが、筋小胞体由来のCa2+-ATPaseを用いた脂質混合系の解析で興味深い結果が得られため、変異体の発現、精製及びナノディスクへの組み込み実験は予備実験のみ行い、筋小胞体由来のCa2+-ATPaseを用いた解析を優先させた。そのため細胞培養、遺伝子導入試薬等の費用が浮いている。
|
