2018 Fiscal Year Research-status Report

分子間ジスルフィド結合を介した小胞体マンノシダーゼEDEMの活性調節機構

Research Project

Project/Area Number	18K06110
Research Institution	Kyoto University
Principal Investigator	岡田徹也京都大学, 理学研究科, 助教 (70378529)
Project Period (FY)	2018-04-01 – 2021-03-31
Keywords	小胞体 / マンノシダーゼ / タンパク質分解
Outline of Annual Research Achievements	小胞体で行われるマンノーストリミングは、小胞体に存在する糖タンパク質の分解において重要な役割を果たす。我々はこれまでに、EDEM1/2/3が小胞体のマンノーストリミングを実行する分子であることを遺伝子破壊解析により示してきた。本研究は、EDEMタンパク質がマンノシダーゼであることを実証するために、EDEM２のパートナー分子の同定、およびin vitro解析によるEDEM2複合体の酵素活性の検出を目的としている。我々はすでに、EDEM2と分子間ジスルフィド結合を形成するチオレドキシン様タンパク質を同定している。平成30年度では、このチオレドキシン様タンパク質に着目した解析を行い、以下のような成果を得た。（１）チオレドキシン様タンパク質の遺伝子破壊株を作成し、この分子を欠損した細胞はEDEM2欠損細胞と同様の表現型を示すこと、すなわち、モデル分解基質であるATF6やCD3δ可溶性変異体のマンノーストリミングと分解が停止することを見いだした。この結果は、同定したチオレドキシン様タンパク質がEDEM2の機能に必須であることを示している。（２）トリプシン感受性アッセイにより、チオレドキシン様タンパク質が欠損するとEDEM2のコンフォメーションが変化することを見いだした。（３）チオレドキシン様タンパク質のシステイン残基に網羅的な点変異導入を行い、EDEM2と分子間ジスルフィドを形成するために必須なシステイン残基を１箇所同定した。(４）EDEM2とチオレドキシン様タンパク質を過剰発現させた培養細胞から、両者の複合体を高純度に精製する２段階精製法を確立した。現在、合成糖鎖や糖タンパク質を基質として、酵素活性を測定するための条件の最適化を行なっている。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 上述のように、30年度の研究として予定していた遺伝子破壊株の作成、EDEM2の機能に必須なパートナー分子の同定、EDEM2複合体の精製手法の確立、にいずれも成功した。31年度は当初の計画にしたがってin vitro解析を本格的に開始する。以上のことから、研究は順調に進展していると判断した。
Strategy for Future Research Activity	EDEM2複合体の精製手法を確立したことから、酵素活性の測定と検出に注力する。現在は条件設定を行なっており、バッファーの種類、基質濃度、基質の変性状態(タンパク質基質の場合)、反応時間について最適化を行う。EDEM2ノックアウト細胞の解析から、EDEM2はM9型糖鎖をM8B型糖鎖へ変換する活性を有すると予想される。in vitro解析の最適化を行なったのち、EDEM2がどのような種類のマンノシダーゼ活性を有するのか、単量体のEDEM2が酵素活性を有するのか、複合体としてのみ酵素活性を発揮するか等について検証する。