2018 Fiscal Year Research-status Report
細胞成長を司るTORC1の活性化を誘導するアミノ酸感知システムの包括的理解
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18K06111
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
荒木 保弘 大阪大学, 歯学研究科, 助教 (60345254)
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2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | TORC1 / アミノ酸 / タンパク質 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
タンパク質の原料であるアミノ酸を細胞は厳密に感知しており、リン酸化酵素を有するTORC1がアミノ酸に依存して細胞内の細胞増殖・成長を制御する。出芽酵母におけるアミノ酸によるTORC1活性化経路として、既知のGtr/Ego経路とは独立した新規経路に介在するPib2を申請者はこれまでに見出している。更に、TORC1活性化経路はGtr/Ego経路とPib2が介在する新規経路（Pib2経路）の二経路しかないことを示し、全てのアミノ酸はこの二経路を経由しTORC1を活性化していることを明らかにしている。本研究では、新規TORC1活性化経路であるPib2経路の全貌及びその制御機構の解明に留まらず、各アミノ酸を感知するタンパク質（アミノ酸センサー）の同定を目的としている。
平成30年度は以下に挙げる点を明らかにした。① TORC1の活性化状態の指標として基質であるSch9のリン酸化状態を検出することを目的に、TORC1によるリン酸化された部位を特異的に認識する抗体を作成した。これにより、化学的処理を必要とした以前の方法よりも格段に迅速かつ簡便に検証できるだけでなく、検出感度が大幅にあがった。② Pib2経路の分子機構を明らかにすることを目的にPib2の物理的・遺伝学的相互作用因子を複数単離・同定した。特にpib2の温度感受性株を独自に作製し、この変異株の多コピー抑圧因子を探索・単離した。③ 栄養源に依存してPib2タンパク質量が制御されていることを見出している。これはユビキチン・プロテアソームを介した分解に依ること、SCFユビキチンリガーゼが関与する予備的知見を得ていた。出芽酵母F boxタンパク質の中から、Pib2分解に関与するものを同定した。以上により、TORC1活性化経路であるPib2経路の全貌及びその制御機構の検証できる段階に至ったと考える。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
増殖・成長に必要不可欠である栄養素は、細胞により厳密に感知され巨大なタンパク質複合体TORC1に情報伝達される。TORC1はそのリン酸化酵素活性を介して細胞成長と代謝を制御する。十分な栄養源存在化でTORC1は活性化し、分解過程であるオートファジーを介した異化作用を抑制すると同時に、リン酸化を介して同化作用（生体内高分子化合物の合成）を亢進する。逆に栄養源がないと不活化し、基質の脱リン酸化を介して、同化作用の抑制、異化作用の亢進を誘導する。
TORC1に相互作用するタンパク質として生化学的に単離・同定した一つがアミノ酸合成酵素であり、これまでTORC1との関連が未知であった。GFPを付加し細胞内局在を検証したところ、飢餓時に液胞膜上にGFPの輝点を形成した。この輝点はTORC1と共局在することから新規TORC1関連因子であると判明した。この酵素の欠損株でTORC1活性に差異は見られなかったので上流因子ではないと判断した。このタンパク質は生体内でリン酸化修飾されており、精製標品を用いた試験管内リン酸化実験により、TORC1が直接リン酸化した。従って、この酵素はTORC1によりリン酸化される下流因子であることが明らかとなった。さらにTORC1を阻害した時の細胞内アミノ酸濃度を測定したところ、この酵素が合成するアミノ酸の細胞内濃度が顕著に減少していた。すなわちTORC1の活性がアミノ酸の細胞内濃度を維持するのに必要であることを意味する。TORC1はタンパク質合成、脂質合成、核酸合成を促進することが知られていたが、今回初めてアミノ酸合成も制御していることが明らかになった。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成30年度の成果をもとに以下の点を明らかにする。① Pib2の物理的・遺伝学的相互作用因子の中から、PIB2遺伝子の欠損がGtr/Ego経路関連因子の破壊株と合成致死を示すことからgtr1破壊株との合成致死となること、Pib2と同じく液胞膜に局在すること、の2点を指標 にPib2経路に関与する候補因子を絞る。② 同定したユビキチンリガーゼの候補が直接Pib2をユビキチン修飾することを、精製標品を用いたin vitro系で検証する。栄養源に依存してPib2タンパク質量が制御されていることを見出している。またPib2が富栄養条件下で過度にリン酸化され、飢餓時に脱リン酸化されることを見出しており、質量分析を用いてリン酸化部位を同定した。リン酸化部位をリン酸化修飾されないアラニンに置換した変異体とアスパラギン酸やグルタミン酸に置換したリン酸化模倣変異体を作製し、Pib2タンパク質の安定性への影響を検証する。③ アミノ酸感知タンパク質(アミノ酸センサー)の指標である個々のタンパク質のアイソトープラベルしたアミノ酸への直接結合能を測定する実験系を確立する。Pib2経路関連因子の中から、アミノ酸に直接結合し、TORC1に 情報を伝達するアミノ酸センサーを単離・同定することを最終年度に行う。
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| Causes of Carryover |
平成30年度に “リン酸化特異的抗体の作製”を外部に委託するため５０万円を計上していた。これにはペプチド合成、ウサギ２羽免疫、全採血と精製吸収作業（リン酸化ペプチド固定化作業、精製作業、非リン酸化ペプチド固定化作業、吸収作業）が含まれる。これらすべてを外部委託するのが一般的であるが、抗体作成の専門家からの助言により精製吸収作業を委託せずに申請者自ら行った。その結果、精製吸収作業代２５万円の経費削減となった。その他の経費はほぼ予定通り使用しているため、この２３万円を基金として翌年度へ持ち越し、研究に必要な他のタンパク質のリン酸化特異的抗体の作製に使用することとした。
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