2018 Fiscal Year Research-status Report
心疾患に関連する新奇生理活性物質 D-グルタミン酸の合成酵素に関する研究
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18K06117
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| Research Institution | Kitasato University |
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Principal Investigator |
片根 真澄 北里大学, 薬学部, 准教授 (90383653)
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2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | グルタミン酸ラセマーゼ / D-グルタミン酸合成酵素 / D-グルタミン酸 / 心臓 / D-アミノ酸 / アミノ酸ラセマーゼ / L-セリンデヒドラターゼ / デヒドラターゼ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は、遊離の D-グルタミン酸（D-Glu）の合成活性を有する酵素として最近同定した、ラット Glu ラセマーゼ（L-Glu と D-Glu の相互変換を触媒する酵素）の機能の詳細を解明することである。本酵素は哺乳類で初めて見出された Glu ラセマーゼであり、細菌で既に同定されている Glu ラセマーゼとは異なるファミリーに属する。本酵素とは別に、我々は最近、生体内で D-Glu を分解する唯一の酵素として D-Glu シクラーゼを同定し、この酵素の欠損マウスの心臓では D-Glu 含量が著しく増加することなどを明らかにした。すなわち、哺乳類は心機能に関連する新奇な生理活性物質として D-Glu を利用していると考えられる。そこで本研究では、ラット Glu ラセマーゼの酵素学的性質・機能のほか、種々のアミノ酸の細胞内および細胞外含量に与える影響の解明を試みる。
平成 30 年度は、大腸菌で発現させて精製したラット組換え Glu ラセマーゼを酵素標品として、本酵素の酵素学的性質・機能を解析した。具体的には、本酵素の（1）オリゴマー構造、（2）反応特異性、（3）基質特異性、（4）補酵素要求性、および（5）補因子要求性を解析した。その結果、本酵素が（1）モノマーとして存在すること、（2）ラセマーゼ反応のみならず、デヒドラターゼ反応も触媒すること、（3）ラセマーゼ反応においては L-Glu と D-Glu を基質とし、デヒドラターゼ反応においては L-セリン、D-セリンおよび L-スレオニンを基質とすること、（4）細菌の Glu ラセマーゼとは異なり、ピリドキサール-5'-リン酸を補酵素として要求すること、および（5）哺乳類で報告されている唯一のアミノ酸ラセマーゼであるセリンラセマーゼとは異なり、金属陽イオンやヌクレオチドを補因子として要求しないことが明らかになった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究の開始当初における研究計画は、主に次の 2 つに大別される。すなわち、1 つは、（1）大腸菌で発現させて精製したラット組換えグルタミン酸（Glu）ラセマーゼを酵素標品として用いて、本酵素の酵素学的性質・機能を解析することである。もう 1 つは、（2）哺乳類由来の培養細胞株を用いて、本酵素が細胞内および細胞外アミノ酸含量に与える影響を解析することである。また、上記（1）の具体的な研究計画は、本酵素のオリゴマー構造、反応特異性、基質特異性、補酵素要求性、補因子要求性、至適 pH、至適温度、および動力学定数を明らかにすることであった。一方、上記（2）の具体的な研究計画は、本酵素遺伝子をノックアウトした哺乳類由来培養細胞株を樹立し、本酵素の細胞内および細胞外アミノ酸含量に与える影響を明らかにすることであった。
平成 30 年度は、主に上記（1）の研究を進め、ラット Glu ラセマーゼのオリゴマー構造、反応特異性、基質特異性、補酵素要求性、および補因子要求性を明らかにした。すなわち、計画していた研究全体の約 35 ～ 40% 程度が進行したと思われる。したがって、本研究は「おおむね順調に進展している」と考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成 31 年度は、平成 30 年度に引き続き、大腸菌で発現させて精製したラット組換えグルタミン酸（Glu）ラセマーゼを酵素標品として用いて、本酵素の酵素学的性質・機能を解析する。具体的には、本酵素のラセマーゼ反応およびデヒドラターゼ反応それぞれにおける至適 pH ならびに至適温度を決定する。また、ラセマーゼ反応およびデヒドラターゼ反応それぞれの反応において基質とするアミノ酸に対する動力学定数を決定する。
さらに、平成 31 年度には、本酵素遺伝子をノックアウトした哺乳類由来培養細胞株を樹立する。もし、目的とするノックアウト株が樹立できない場合には、当教室で既に確立・経験済みの siRNA を用いたノックダウン法により本酵素遺伝子の発現を抑制した細胞株を樹立して対応する。また、ノックダウン法による発現抑制株の樹立も難しい場合には、当教室で既に確立・経験済みの遺伝子導入法により本酵素遺伝子を高発現させた細胞株を樹立して対応する。
平成 32 年度には、樹立したノックアウト株、ノックダウン株、または高発現株の細胞内および細胞外（培養上清中）の D-Glu 含量を経時的に測定し、本酵素が生体内において D-Glu 合成酵素として機能しているかどうかを確認する。同様に、D-Glu 以外のアミノ酸含量に与える影響も解析する。
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