2018 Fiscal Year Research-status Report
ユビキチンリガーゼUBR4の組織特異的生理機能と分子機構
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18K06119
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| Research Institution | Kanazawa Medical University |
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Principal Investigator |
田崎 隆史 金沢医科大学, 総合医学研究所, 准教授 (70629815)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
佐々木 宣哉 北里大学, 獣医学部, 教授 (20302614)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 翻訳後修飾 / ユビキチンリガーぜ / N-end rule pathway / 病態モデル |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ユビキチンリガーゼUBR4はタンパク質のユビキチン化を担う翻訳後修飾酵素で、腎臓足細胞のポドシンやミトコンドリアPINK1の安定性、ヒトパピローマウイルスによる発がん、オートファジー経路等、多種多様な生理現象に関わっていることが示唆されている。本研究では、成体における生理学的役割とその分子機構を明らかにするために、コンディショナルノックアウト（CKO）マウスを用いて組織特異的にUBR4遺伝子を不活化させ、個体及び遺伝子発現の変化を解析する。それと並行して腎臓や脳等、特定の臓器からUBR4結合因子を精製し、既存および未知の標的基質の同定を試みる。平成30年度では、CKOマウスの作成とUBR4結合因子精製のための研究を行った。腎臓足細胞、腸管上皮細胞、肝細胞特異的UBR4遺伝子KOマウスを作成し、このうち腸管上皮細胞特異的UBR4遺伝子KOマウス（以下、Vill-Cre:UBR4CKOマウス）において興味深い結果を得た。Vill-Cre:UBR4CKOマウスでは、UBR4を欠損させてもマウスは正常であったが、AOM/DSS投与により大腸炎を誘発させると、血便、元気消失、体重減少がみられ潰瘍性大腸炎を伴い死亡した。一方、コントロール固体は生存した。投与後1-4日のJak-Statなど潰瘍性大腸炎遺伝子の発現は差がないため、従来とは異なるメカニズムで大腸炎を引き起こしている可能性がある。UBR4結合因子の精製については、その精製に必要なペプチドビーズやHPV-E7タンパク質を作製した。プロテオミクス解析を行う準備中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
UBR4結合因子精製法の確立のため、UBR4精製用ペプチドビーズおよびUBR4に結合するHPV-E7タンパク質を準備した。UBR4精製用ペプチドビーズはPheをN末端アミノ酸残基とする12アミノ酸残基のペプチドをアフィニティークロマトグラフィー用ビーズに結合させて作製した。HPV-E7組換えタンパク質は大腸菌発現システムを用い抗FLAG抗体ビーズを用いて精製した。今後は、ペプチドビーズとHPV-E7を用いてUBR4特異的結合因子の精製を行う。
腎臓足細胞特異的Podocin-Cre、腸管上皮細胞特異的Villin-Cre、肝細胞特異的Albumin-Cre発現マウスとUBR4CKOマウスを交配することで、腎臓足細胞、腸管上皮細胞、肝細胞特異的UBR4遺伝子KOマウスを作成した。このうち、腸管上皮細胞特異的UBR4遺伝子ノックアウトマウス（以下、Vill-Cre:Ubr4CKO）と肝細胞特異的UBR4遺伝子ノックアウトマウス（Alb-Cre:UBR4CKO）の成体を得ることができた。腎臓足細胞特異的遺伝子ノックアウトマウスについては、生まれた個体を確認できておらず胎生致死である可能性がある。Vill-Cre:UBR4CKOおよびAlb-Cre:UBR4CKOともに、目立った異常は見られなかったた。そこで、Vill-Cre:UBR4CKOを使用して腸炎関連大腸がんモデルマウスを作成した。アゾキシメタンおよびデキストラン硫酸ナトリウム投与後、Vill-Cre:UBR4CKOでは血便、元気消失、体重減少がみられ潰瘍性大腸炎を伴い死亡した。一方、コントロール固体は生存した。投与後1-4日のJak-Statなど潰瘍性大腸炎遺伝子の発現は差がないため、従来とは異なるメカニズムで大腸炎を引き起こしている可能性がある。
以上のことから、現在までの進捗状況はおおむね順調に進展していると言える。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでの研究成果は、腸管上皮細胞特異的UBR4遺伝子ノックアウトマウスはAOM/DSS投与による大腸炎を劇症化すること、すなわちUBR4は大腸炎劇症化のメカニズムに重要な役割を果たしている可能性を示唆している。しかし、リアルタイムPCRを用いた炎症関連遺伝子の解析では差が見られなかった。そこで網羅的な遺伝子発現解析をRNA-seq法を用いて行い、腸管上皮細胞におけるUBR4の機能解析を行うための手がかりを検索する。肝細胞特異的UBR4遺伝子KOマウスにおいては、NASHモデルなどの病態モデルを用いることにより、UBR4遺伝子の関与について検討する計画である。UBR4結合因子の精製は、特定のマウス組織をターゲットにするが、ヒト腸管上皮細胞由来の細胞株等の培養細胞も用いる計画である。また、遺伝子解析やプロテオミクス解析による候補タンパク質の検証のため、マウス胎児由来線維芽細胞株（MEF)や293細胞のUBR4欠損株を作成し、タンパク質相互作用、タンパク質分解解析に使用する予定である。
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| Causes of Carryover |
これまでの研究成果は、腸管上皮細胞特異的UBR4遺伝子ノックアウトマウスはAOM/DSS投与による大腸炎を劇症化すること、すなわちUBR4は大腸炎劇症化のメカニズムに重要な役割を果たしている可能性を示唆している。しかし、リアルタイムPCRを用いた炎症関連遺伝子の解析では差が見られなかった。そこで網羅的な遺伝子発現解析をRNA-seq法を用いて行い、腸管上皮細胞におけるUBR4の機能解析を行うための手がかりを検索する。前倒しで行う予定であったため、平成31年度分から前倒し支払い請求を行い30万円を調達した。しかし、当初２サンプルであった次世代シーケンス解析を4サンプルにすることにしたため、サンプル調整に準備がかかり平成30年度中での解析終了が間に合わなかったため次年度使用額が生じた。
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