2018 Fiscal Year Research-status Report
Ｃｌａｓｐｉｎのリン酸化と形態変化による複製フォーク複合体の活性制御機構の解析
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18K06124
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| Research Institution | Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science |
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Principal Investigator |
Zhiying You 公益財団法人東京都医学総合研究所, ゲノム医科学研究分野, 主席研究員 (90332270)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | Claspin / MCM2-7 / Cdc7キナーゼ / DNA複製 / DNAヘリカーゼ / 複製フォーク |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ClaspinとMCMを中心とした複製フォーク複合体の分子構築と活性化制御の解明を目標に研究を始め, 次の様な成果を得た。
野生型Claspinと５種類のClaspin変異体を精製し、Cdc7キナーゼによるリン酸化、DNA結合、ヘリカーゼ活性などの生化学的なアッセイを行った。１）Claspinの分子内結合の役割を解明するために、Claspinの分子内結合をするバリアントでは、Cdc7によるリン酸化やDNA結合活性への影響は認められない。２）野生型ClaspinとCdc7のリン酸化を受けないClaspin_DE/A変異体を用いて、リン酸化によるClaspinのDNA結合能に差が認められない。また、MCMの存在下によるClaspinとMCMのDNA結合が促進された。３）ヒトClaspinはDNA ポリメラーゼεと相互作用するが、DNAポリメラーゼεの酵素活性には影響しないことを見出した。これは出芽酵母Mrc1がDNAポリメラーゼεの活性を促進する報告と異なった。４）Claspinの存在によるMcm2-7複合体のDNAヘリカーゼ活性が阻害される結果を得た。このように、Claspinによる複製フォーク進行制御機構に関わることを示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
計画されていた実験が順次行われていた。ClaspinはDNA上にMCMと複合体形成し、MCMのDNAヘリカーゼ活性を阻害することを見出した。
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| Strategy for Future Research Activity |
引き続き、ClaspinとMCMを中心とした複製フォーク複合体の活性化制御機構の解明を進める。さらに、MCMと結合するFACT複合体がClaspinのMASS解析で同定されたため、そのサブユニットのSpt16とSSRP1を293T細胞にタンパク発現と精製を行う。FACTがClaspin、MCMとの物理的な相互作用や活性への影響を調べる予定である。
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| Causes of Carryover |
試薬が思ったより安く買えた。これから、ClaspinによるMCMのDNAヘリカーゼ活性の阻害メカニズムを明らかにするため、より多く使うと思う。
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| Remarks |
研究室HPのURL
http://www.igakuken.or.jp/genome/
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