COPII小胞形成反応における膜の形態による制御機構の解析

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K06126
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 依光 朋宏 東京大学, 大学院総合文化研究科, 助教 (00534364)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 小胞体 / 膜構造 / 小胞輸送 / COPII

Outline of Annual Research Achievements

小胞体膜上のCOPII小胞形成ドメインER Exit Sitesは、COPII因子が集まり形成されているが、その機能が小胞体膜構造によりどのように制御されているかは不明である。昨年度までに、小胞体膜ネットワーク構造を破壊するrtn1/ yop1出芽酵母変異体を用いた解析により、COPII因子の機能ならびにサブユニット間の相互作用が小胞体の膜構造により調節される可能性を示唆する結果が得られた。
本年度はこの結果をさらに発展させるためにER Exit Sitesの形態について調べた。蛍光タンパク質を融合したCOPIIサブユニットを発現する温度感受性Sec16L1089P変異体細胞を用いてER Exit Sitesを蛍光顕微鏡により観察した。Sec16L1089Pは高温環境下ではその機能が阻害されるため発現する細胞の生育も阻害されるが、rtn1/ yop1変異により生育阻害が抑制される。また、Sec16L1089PはCOPIIサブユニットのER Exit Sites局在を阻害するが、rtn1/ yop1変異バックグランドでも同様にER Exit Sitesへの局在が阻害されたままであることを明らかにした。さらに、蛍光タンパク質を融合したSec16L1089P は、野生型バックグラウンドでは細胞質中のシグナルが増えER Exit Sitesへの局在に異常をきたすが、種々の条件で検証したがrtn1/ yop1変異体においても同様にER Exit Sitesへの集合が阻害されていることを見出した。以上の結果はrtn1/yop1変異による小胞体ネットワーク構造異常に伴うSec16L1089Pの必須機能の回復には、Sec16L1089P 機能阻害に伴う異常ER Exit Sitesの再構築が少なくとも大規模には必須ではないことが示唆された。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

令和２年度にSec16L1089Pを発現するrtn1/yop1変異体を用いたER Exit Siteの蛍光顕微鏡による解析に加えて、in vitro再構成実験を行う予定であった。その実験系に使用する精製COPIIタンパク質の調整は行えており、令和3年度に再構成実験を行う。

Strategy for Future Research Activity

小胞体ネットワーク構造に異常をきたす変異体細胞から小胞体膜を調整し、精製したCOPIIタンパク質を反応させin vitroで小胞形成反応を再構成する。小胞体ネットワーク構造とCOPII小胞の形成反応との機能的関連性の解析を進める。

Causes of Carryover

コロナウイルス感染拡大に伴い構成員の大学内への立ち入りが大幅に制限された。このため当初計画した実験、特にin vitro再構成実験の実施に支障をきたした。また予定していた学会への参加できなかった。このような状況のため次年度使用額が生じたが、研究計画に従い未実施の実験ならびに継続実験に必要な試薬や消耗品の購入、及び学会などでの研究成果の発表への必要な経費に使用する