2018 Fiscal Year Research-status Report
細菌外膜LPSトランスロコン生合成におけるBepAの作動機構の解析
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18K06136
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| Research Institution | Morioka College |
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Principal Investigator |
成田 新一郎 盛岡大学, 栄養科学部, 教授 (30338751)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 細胞内タンパク質分解 / 表層ストレス応答 / 細菌細胞表層 / プロテアーゼ / 外膜タンパク質 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
大腸菌のペリプラズムに存在するプロテアーゼのBepAは、LptDなどの外膜タンパク質のアセンブリを促進するシャペロンとして働く一方、アセンブリに失敗した外膜タンパク質を分解除去するプロテアーゼとしても働く。本研究はBepAが外膜タンパク質のアセンブリ状態を識別し、シャペロン活性とプロテアーゼ活性を使い分ける機構を明らかにすることを目的としている。平成30年度には本研究課題と関連する共同研究の結果から、BepAの立体構造がX線結晶構造解析により決定され、BepAを構成するドメインの相対的配置や、プロテアーゼ活性部位の位置に関して重要な知見が得られた（J. Mol. Biol. 431: 625-635）。そこで平成30年度は、結晶構造解析により明らかとなった立体構造をBepAが実際に細胞内においてとっているかどうかを検証した。BepAはN末端側のプロテアーゼドメインとC末端側のTPRドメインから構成されるが、結晶構造ではプロテアーゼドメインの複数のαヘリックスが、TPRドメインのN末端側と強く相互作用していた。また、プロテアーゼドメインのN末端側はTPRドメインのC末端側に存在するアミノ酸との間で水素結合を形成していた。これらの相互作用に関わる残基をシステインに置換したところ、S-S結合が形成されたことから、細胞内においてもBepAが結晶構造と同様のコンフォメーションを取ることが明らかとなった。これらのS-S結合を形成したBepA変異体は、in vivoにおいて野生型BepAの機能を代替したことから、BepAの機能発現にはドメイン間の大きなコンフォメーション変化は必要ないことが示唆された。結晶構造ではBepAのプロテアーゼの活性中心は、プロテアーゼドメインのヘリックスやループに覆われており、プロテアーゼ活性を発揮するためには構造変化が必要であることが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究の主要な目的は、BepA-LptD間の時間分解相互作用解析とBepAのシャペロン／プロテアーゼ活性の解析である。平成30年度は後者の解析を進める上で重要な知見がX線結晶構造解析の結果からもたらされたことから、当初の実験計画を修正し、変異体の作製と機能解析に注力して研究を進めた。その結果、BepA-LptD間の時間分解相互作用解析に関しては、当初の実験計画に比べて進捗が遅れている。一方、X線結晶構造解析の結果からBepAのドメイン間相互作用の様子や、プロテアーゼ活性中心の環境について新たな知見が得られたことから、BepAのシャペロン／プロテアーゼ活性の解析に関しては大きな前進が得られた。以上のような進捗状況を総合すると、本研究課題はおおむね順調に進展していると判断される。
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| Strategy for Future Research Activity |
X線結晶構造解析の結果から、定常状態ではBepAのプロテアーゼ活性中心に基質が接近できない可能性が示唆された。したがって、BepAがプロテアーゼ活性を発揮するためには構造変化が必要であると考えられる。この可能性を検証するため、これらの領域に変異を導入した変異体を作製し、in vivoおよびin vitroでプロテアーゼ活性を測定する。これまでに、BepAがin vitroにおいてα-カゼインを分解することがわかっている。しかし、BepAのプロテアーゼ活性を定量的に測定する実験系は構築されていない。今後の研究においてBepA変異体を用いることにより、プロテアーゼの反応速度論的解析を可能とする実験系を構築する。また、in vitro実験系を用いてBepAのプロテアーゼ活性の基質特異性についても検討することにより、生理的基質であるLptD の分解機構を推定する。BepA-LptD間の時間分解相互作用についても、構築したBepA変異体を活用して解析を行う。
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| Causes of Carryover |
（理由）当初の計画では、BepA-LptD間の時間分解相互作用解析とBepAのシャペロン／プロテアーゼ活性の解析を並行して実施することを計画していた。前述したように、本研究課題の開始直前に本研究課題と関連する共同研究の結果から、BepAの全長にわたる立体構造がX線結晶構造解析により決定され、BepA分子内ドメインの相対的配置やプロテアーゼ活性中心の環境に関して重要な知見が得られた。そこで平成30年度は当初の実験計画を若干修正し、変異体の作製と機能解析を中心に研究を遂行したため、エピトープタグを用いない野生型BepAの精製など、当初予定していた実験に必要な試薬等の購入を見合わせた。
（使用計画）BepA変異体の作製・精製、及びそれらを用いたin vitroプロテアーゼ活性測定実験に必要な試薬・消耗品の購入に次年度使用額を充てる。
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