2019 Fiscal Year Research-status Report
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18K06140
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| Research Institution | Kyoto Sangyo University |
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Principal Investigator |
潮田 亮 京都産業大学, 生命科学部, 准教授 (30553367)
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2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | レドックス / 小胞体 / 分子シャペロン / カルシウム / タンパク質品質管理 / 小胞体関連分解 / ストレス応答 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
小胞体内腔はサイトゾルと比較して非常に酸化的な環境であり、これまで還元酵素の存在は明らかにされてこなかった。2008年、代表者らは世界で初めて小胞体内腔で還元酵素として働くERdj5を同定した（Ushioda et al., Science 2008）。これまで、酸化反応の場としてのみ信じられていた小胞体内腔において、還元酵素ERdj5の発見によって小胞体における還元反応の重要性が次々と明らかになった。
我々は、これまで不明であったSERCA2bの還元メカニズムに対して、ERdj5の還元活性が寄与しているのではないかと考え、ERdj5とSERCA2bとの関係に焦点をあてた。哺乳類細胞を用いた実験の結果、ERdj5はSERCA2bのジスルフィド結合を開裂し、SERCA2bのポンプ活性を活性化していることを明らかにした（Ushioda et al., PNAS 2016）。なぜ還元されるとSERCA2bのポンプ活性は活性化されるのか、構造学的見地から解析を進めており、世界で初めてSERCA2bの酸化型および還元型の結晶構造解析に成功した（Inoue et al., Cell Reports. 2019）。今年度は、特にERdj5以外のレドックス因子よる放出チャネルIP3受容体制御について、詳細に検証を行った。検証を行うためにCRSPR/Cas9を用いて、ノックアウト細胞をレドックス因子に対して20種類程度樹立した。ノックアウト細胞を用いて、小胞体内腔のカルシウム恒常性への影響を観察した。また、レドックス因子欠損の影響がレドックス環境変化でないことを証明するために、新たにレドックスセンサーを開発し、系に導入した。いくつかのレドックス因子は、レドックス環境に変化を与えるが対象とする制御因子は直接カルシウム輸送体を制御することを証明した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
SERCA2およびIP3受容体に対して、小胞体内腔の代表的なレドックス因子がどのように影響するかを調べた。レドックス因子約20種類に対してCRSPR/Cas9レドックス因子が小胞体内腔およびサイトゾルのカルシウム濃度に影響を与えるか、新たにカルシウムセンサーを細胞に導入し、観察した。また、レドックス因子の欠損によって、小胞体内腔のレドックス環境が大幅に変化する可能性があるため、新たに小胞体レドックスセンサー（酸化型グルタチオン：還元型グルタチオン比を評価できるもの）を作製し、系に導入した。これまで開発されてきたレドックスセンサーよりも、酸化的環境をモニター出来るように最適化されたセンサーを用いることで、これまで以上に正確に小胞体内腔のレドックス環境を観察した。
これまで証明してきたレドックス因子によるカルシウム恒常性は、環境自体を変化させているのではなく直接、ポンプやチャネルを制御することが証明された。
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| Strategy for Future Research Activity |
いくつかのレドックス因子とIP3受容体の欠損を組み合わせた細胞または、入れ戻し実験により、我々の主張を証明する必要がいくつか残っている。レドックス因子依存的なIP3受容体制御に関して、早急に論文にまとめたい。それらを優先的に進める必要がある。また、予定していたカルシウムポンプ及びチャネルに対するインタラクトーム解析を行う予定である。これまでジスルフィド結合依存的な結合は、酵素反応の場合、非常に速やかに結合・解離が起こるため、捕捉することが困難であった。最近、代表者と産総研の新木主任研究員によって、ジスルフィド結合依存的なクロスリンカーを用いることで安定的に反応中間体を捕らえ、これまでに検出できなかった基質を検出することが可能となった（Araki, Ushioda et al. Anal. Biochem 2017）。このクロスリンカーを用い、カルシウム輸送体のジスルフィド結合依存的な結合因子を同定する。
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| Causes of Carryover |
条件検討に時間をかけたため、特に相互作用解析に必要な一部消耗品費を繰越しする。
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