2018 Fiscal Year Research-status Report
Cell-free approach to design cellulose nanofibers
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18K06142
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| Research Institution | Okinawa Institute of Science and Technology Graduate University |
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Principal Investigator |
中島 啓介 沖縄科学技術大学院大学, マリンゲノミックスユニット, 研究員 (10422924)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
今井 友也 京都大学, 生存圏研究所, 准教授 (90509142)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 無細胞発現 / セルロース / セルロース合成酵素 / 被嚢動物 / ホヤ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
研究計画通りに無細胞合成系を用いたセルロース合成酵素の発現系を立ち上げている。異なる生物種に由来する細胞抽出液を用いて条件検討を重ねた結果、150-200kDaの比較的大きいサイズのセルロース合成酵素を発現できる条件を見出した。発現対象であるセルロース合成酵素についても、最新のゲノム情報を対象としたオーソログ解析を通じて、やはり動物界においては被嚢動物のみがセルロース合成酵素を有することを報告した。無細胞合成に際して、適当なタグ配列をセルロース合成酵素に加えることに作業上の多くの利点がある。そこで、各種タグを用いて、合成やアフィニティ精製に与える影響をウェスタンブロットで評価・検討したところ、それぞれの抽出液にはそれぞれ使い勝手の良いタグ種が存在することがわかった。セルロース合成酵素は膜タンパク質であるため、適当な疎水性環境が存在しない限り、無細胞合成された直後にアグリゲーションを起こして沈殿となる。そこで次に、合成されたセルロース合成酵素が機能的な状態にフォールディングするために適当な疎水性環境を見いだすことを目的として、無細胞反応液中に人工的な疎水性環境を組み込み、反応後に超遠心分離あるいは密度勾配分離を行い、疎水性環境への取り込み具合を評価した。各種脂質を用いて調製したリポソームや、脂質と各種界面活性剤で構成される混合ミセルは、無細胞合成反応そのものを阻害することが多かったが、いくつかの条件においては、少なくともウェスタンブロット系においてはさほど阻害せず、かつ合成産物の７割程度が脂質環境に取り込まれることがわかった。この様に、無細胞合成に大切な要素である細胞抽出液・セルロース合成酵素・脂質環境の検討を進めたことにより、今後の計画推進が加速するものと思われる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
以下の通り、本計画を推進する上で大切な要素である細胞抽出液・セルロース合成酵素・脂質環境の検討を進めたことにより、今後の計画推進が加速するものと思われる。
まず、異なる生物種に由来する細胞抽出液を用いて条件検討を重ねた結果、150-200kDaの比較的大きいサイズのセルロース合成酵素を発現できる条件を見出した。発現対象であるセルロース合成酵素についても、最新のゲノム情報を対象としたオーソログ解析を通じて、やはり動物界においては被嚢動物のみがセルロース合成酵素を有することを報告した。無細胞合成に際して、適当なタグ配列をセルロース合成酵素に加えることに作業上の多くの利点がある。そこで、各種タグを用いて、合成やアフィニティ精製に与える影響をウェスタンブロットで評価・検討したところ、それぞれの抽出液にはそれぞれ使い勝手の良いタグ種が存在することがわかった。セルロース合成酵素は膜タンパク質であるため、適当な疎水性環境が存在しない限り、無細胞合成された直後にアグリゲーションを起こして沈殿となる。そこで次に、合成されたセルロース合成酵素が機能的な状態にフォールディングするために適当な疎水性環境を見いだすことを目的として、無細胞反応液中に人工的な疎水性環境を組み込み、反応後に超遠心分離あるいは密度勾配分離を行い、疎水性環境への取り込み具合を評価した。各種脂質を用いて調製したリポソームや、脂質と各種界面活性剤で構成される混合ミセルは、無細胞合成反応そのものを阻害することが多かったが、いくつかの条件においては、少なくともウェスタンブロット系においてはさほど阻害せず、かつ合成産物の７割程度が脂質環境に取り込まれることがわかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
初年度は概ね計画通りに進めることができたため、引き続き計画に沿って進める。初年度の取り組みを通じて、適切な疎水性環境を準備することが肝要との感触を得ており、これを中心的な問題意識とする。適切とは、無細胞合成反応そのものは阻害することなく、合成産物がより効率的に正しいフォールディングを持って組み込まれることを意味する。その適切さを評価するために必要な実験系は初年度に確立することができたので、今後はそれを活かしてより多くの条件を試し、何らかの方向性をつかむことが大切に思われる。
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| Causes of Carryover |
反応系のスケールダウンに成功したこと、および条件検討が円滑に勧められたため、使用した試薬の量が計画に比して少なく済ませられたことが第一の理由である。ついで、初年度の成果を受けて、２年目に想定した作業に必要となる試薬代が増えるであろうこと、および初年度に参加予定であった海外学会に参加せず、予定にはなかった２年目に参加することになったこと、これらの事情を受けて、必要と思われる試薬代および取りやめになった旅費は当然２年目にあるべきであると考えられたため、次年度使用額が生じた。以上の理由から明らかな様に、初年度から２年目に持ち越した額は２年目に有効に活用される計画となっている。
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