Cell-free approach to design cellulose nanofibers

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K06142
• Research Institution: Okinawa Institute of Science and Technology Graduate University
• Principal Investigator: 中島 啓介 沖縄科学技術大学院大学, マリンゲノミックスユニット, 研究員 (10422924)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 今井 友也 京都大学, 生存圏研究所, 准教授 (90509142)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 無細胞タンパク発現 / セルロース / セルロース合成酵素 / ホヤ / 膜タンパク質

Outline of Annual Research Achievements

研究計画に沿って、無細胞タンパク合成系を用いた機能的なセルロース合成酵素の発現系を立ち上げている。本年度はまず、ホヤ幼生ならびに幼若体を対象としたRNA-seq解析を行い、セルロース合成酵素遺伝子転写産物の詳細な検討を行った。同定した主たる転写産物は、昨年度の発現実験に用いたDNAコンストラクトの配列と数十塩基の相違が認められた。そこでPCR法による変異導入を行い、コンストラクトの配列を訂正した。新しいコンストラクトを用いて無細胞タンパク合成を試み、ウェスタンブロッティング法により合成を確認した。昨年度決定したリポソーム条件において、無細胞合成タンパクの７割量がリン脂質画分に存在することを密度勾配分離法にて確認した。現在この画分を用いて放射性同位元素で標識した基質の取込み活性を評価しているところである。従来、リポソーム作成には標準合成脂質を単一組成で用いてきたが、天然由来の総脂質を用いることで取込み活性に変化が生じることを示すデータが得られている。これは膜タンパク質の活性発現に対する脂質環境の重要さを示していると理解されるため、至適脂質環境条件の検討も行なっている。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

第一の理由は、本研究計画の骨子となる無細胞タンパク合成系において、膜タンパク質であるホヤセルロース合成酵素の安定した合成に成功していることが挙げられる。第二に、RNA-seqによる詳細な解析を行い、ホヤセルロース合成酵素の配列を本来の発現産物に近づけられたことが挙げられる。第三に、機能評価のための放射性同位元素実験系が機能していることが挙げられる。これらの理由から、おおむね順調に進展していると判断された。

Strategy for Future Research Activity

上述の通り、これまで構築してきた実験系が順調に機能しているため、当初の研究計画に従って今後も研究推進する予定である。すなわち、合成したセルロース合成酵素の活性を放射性同位元素の取込み活性を指標として評価する。上記概要欄に述べたとおり、リポソーム構成脂質の組成の違いにより活性の変化が生じているため、脂質環境条件の検討も行う。求めた至適条件における合成産物セルロース結晶の構造分析を行う。

Causes of Carryover

予算に計上していた一部の試薬（放射性同位元素試薬など）について、すでに手元にあった試薬で作業がまかなえたため、新規購入せず、その予算が来年度に持ち越しとなった。これは、コンストラクトの再構成に時間を要したため、活性評価実験の回数が少なくなり、その分試薬の消費が遅れたことに由来する。遅れた分は次年度に持ち越して使用される見込みである。