2020 Fiscal Year Research-status Report
Cell-free approach to design cellulose nanofibers
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18K06142
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| Research Institution | Okinawa Institute of Science and Technology Graduate University |
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Principal Investigator |
中島 啓介 沖縄科学技術大学院大学, マリンゲノミックスユニット, 研究員 (10422924)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
今井 友也 京都大学, 生存圏研究所, 准教授 (90509142)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 無細胞発現 / セルロース / セルロース合成酵素 / 被嚢動物 / ホヤ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
研究計画に沿い、無細胞合成法を用いて、セルロース合成酵素タンパク質を合成と同時に人工脂質環境に組み込む実験系を確立した。密度勾配分離法により、合成タンパクの７割がリポソームと挙動を同じくすることを確かめた。同リポソーム画分を対象に、放射性同位元素で標識した基質の取り込み活性を評価し、同活性はpH・カチオン濃度・温度依存的に変化することを見出した。測定された基質取り込み活性値と反応溶液中に含まれるタンパク質量をモル濃度換算したところ、反応溶液中に存在するセルロース合成酵素分子のうち、機能的な状態にあるものは全体の１割程度に留まることが示唆された。そこで、なぜ残りの９割は合成されるも活性を示さないのか、その理由を探った。まず、カタユウレイボヤ生体から調製した機能的な天然型セルロース合成酵素がリン酸化された状態にあることを各種ゲル電気泳動法から明らかにした。次に、液体クロマトグラフィータンデム質量分析法による網羅的なリン酸化ペプチドーム解析を行い、リン酸化部位を特定した。特定部位は、RNA-seq解析で特定した新規な領域に含まれていた。無細胞合成系はリン酸化を含む各種翻訳後修飾が効率的に行われないことから、それらが原因となり合成産物が機能を発揮しない可能性が示された。同様に、無細胞合成産物が脂質環境に取り込まれず、正しいコンフォメーションを取れないことが膜タンパク質一般に報告されている。よって、セルロース合成酵素に固有の問題と膜タンパク質の無細胞合成に一般的な課題として、それぞれに対応する必要があると考えられる。このように新規実験系を導入し、新たな課題を得つつ、着実に動物のセルロース合成酵素に関する知見を深められた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究開始以来、無細胞合成・合成産物の分離精製・活性の評価に必要な実験系を新たに確立しており、RNA-seqや質量分析など新規技術を積極的に導入して、新規転写産物やリン酸化部位を同定することに成功し、計画成就に向けて着実に進められているため。
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| Strategy for Future Research Activity |
概要に記した通り、対象分子に固有の課題（リン酸化）と無細胞合成系に一般的な課題に直面している。前者に対しては従来の分析をより詳細に進めることで対応し、後者に対しては分野に共通の課題としてより積極的に新規技術を導入するなど、個別に対応する必要があると心得ている。
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| Causes of Carryover |
予算に計上していた試薬の一部について、当該年度以前に購入して手元にあった試薬で作業がまかなえたため、新規購入せず、その予算が次年度に持ち越された。また、コロナの影響で旅費の大半が使用されないまま、次年度に持ち越された。
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