ウイルスのプロテアーゼの基質認識機構

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K06144
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 村松 知成 東京大学, 大学院農学生命科学研究科(農学部), 特任准教授 (70212256)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: SARS / コロナウイルス / ポリタンパク質 / プロテアーゼ / 3CLプロテアーゼ / メインプロテアーゼ

Outline of Annual Research Achievements

SARSコロナウイルス(SARS-CoV)3CLプロテアーゼ前駆体における成熟タンパク質C末端切断箇所を含む領域の酵素活性阻害効果を調べた。
ポリタンパク質中の3CLプロテアーゼ領域の、それぞれ前後10アミノ酸残基を含む領域を大腸菌無細胞タンパク質合成系で合成させ、プロ体モデルとした。この際、野生型、N末端側プロセス部位P1部位の置換体(Gln→Asn)、C末端側プロセス部位P1部位の置換体(Gln→Asn)、両P1部位の置換体、の4種を作成した。これらは、無細胞タンパク質合成系での発現直後に、自己のプロテアーゼ活性により、成熟型、N末端側のみ未成熟型、C末端側のみ未成熟型、両端未成熟型のプロ体モデルとなる。これらの成熟型/プロ体の酵素活性を測定したところ、プロ体から成熟型への変換による活性化は、N末端プロセシングにより約5倍、C末端側プロセシングにより約4倍、双方あわせて約20倍であることが分かった。N末端プロセシングは酵素の活性中心の立体構造形成に重要であることが知られていたが、C末端のプロセシングの役割については知見がない。そこで、C末端付近の領域は成熟型であってもフレキシブルな構造をとっていることから、この領域自体が酵素活性に対する効果を持つと考えた。このC末端プロセシングはプロテアーゼ領域N末端側をはじめポリタンパク質中の他の3CLプロテアーゼ切断箇所とは異なる認識でなされておりP2Phe+P3'Pheが必要である（N末端側はP2はLeuでP3'認識はない)。これは成熟体のC末端による阻害活性を低減させるためのウィルスの戦略かもしれない。C末端のP1部位をLeuに変換した成熟型変異体では活性がP2=Pheの野生型に比べて活性が低下しているが、これは野生型ではC末端プロセシングによりP3'Pheが失われ、P2=Pheでの結合はP2=Leuでの結合にくらべて弱いために阻害効果が低減しているためだと考えられる

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

3CLプロテアーゼについて成熟型酵素のC末端側のプロセシングによる活性化については、これまでにも指摘がなく、メカニズムも不明であるが、この領域にペプチドとしての阻害効果があると考え、変異導入およびプロ配列の有無による活性変化を調べている。この領域が酵素活性ポケットに結合した構造解析も行うとともに、C末端4アミノ酸残基に対応する化学合成ペプチドの阻害活性の解析も始めており、おおむね順調に進展していると考えている。

Strategy for Future Research Activity

近縁のウイルスのポリタンパク質のプロセシングに関わるプロテアーゼについての同様な研究を進めるとともに、半年前に出現し現在猛威を振るっている新型コロナウイルス（SARS-CoV-2）3CLプロテアーゼについても研究を進める。こちらはC末端切断箇所付近のアミノ酸配列がSARS-CoV 3CLプロテアーゼのものとは異なっているので、異なる認識機構で成熟化が進むのか、別の箇所での差異により、原理的な共通性が保たれているのかが興味があるとともに、もし共通のメカニズムが存在するのであれば、そのメカニズムが創薬ターゲットとなると考えられる。