Specificity of SARS-CoV 3CL protease

2020 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 18K06144
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 村松 知成 東京大学, 大学院農学生命科学研究科(農学部), 特任准教授 (70212256)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: SARS / コロナウイルス / ポリタンパク質 / プロテアーゼ / 3CLプロテアーゼ / メインプロテアーゼ

Outline of Annual Research Achievements

SARSコロナウイルス(SARS-CoV)では、宿主への感染直後、ゲノムRNAが宿主細胞のタンパク質合成系により翻訳され、ナンセンスコドンリードスルーの有無により790 kDa および486 kDaの2種のポリタンパク質が合成されるウイルスの増殖に必要な酵素群はこの中に含まれるが、これらは特異的なプロテアーゼによって切り出されてくる。この切り出しは、ほとんどの箇所について、3CLプロテアーゼが行うが。このプロテアーゼ自体ポリタンパク質中に含まれ、自身のプロテアーゼ活性により切り出された後、ホモ二量体化することにより成熟型の酵素分子となる。3CLプロテアーゼの自己プロセシング過程を調べる目的で、プロテアーゼ領域の前後10アミノ酸残基を含む形のペプチドとして、大腸菌無細胞タンパク質合成系で発現させたところ、N末端側、C末端側ともに正しくプロセシングが起きていた。これらのプロセス部位についてP1部位をアスパラギン酸に変換すると、N末端側プロセス部位変異体はC末端側のみ切断が起き、C末端側プロセス部位変異体はN末端側のみ切断が起き、両方変異を入れたものはどちらの箇所も切断されていなかった。以上のようにして作成した野生型並びに変異体タンパク質を、成熟型、N末端プロ体、C末端プロ体、双方プロ体のモデルとし、基質として、同じく大腸菌無細胞タンパク質合成系で作成した不活性型プロ体C145Aと、その２量体化ドメインを含む中央領域を他のタンパク質で置換した酵素と二量体として結合できないペプチドを用いて活性を測定した。この結果、プロ体においても二量体化により活性を発揮していることが示された。それぞれの変異体酵素の活性から10種の中間体(二量体)の活性(kcat/KM)を見積り、シミュレーションにより成熟化過程を推定した。