2018 Fiscal Year Research-status Report
細胞内輸送方向を左右する細胞質ダイニン構造状態のライブイメージング
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18K06147
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
島 知弘 東京大学, 大学院理学系研究科(理学部), 助教 (60631786)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 蛍光共鳴エネルギー移動 / 細胞骨格系モータータンパク質 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
真核生物内での多くの生命機能にとって、細胞内で物質が正しい方向へ輸送されることは非常に重要である。そのためには、微小管上においてそれぞれ逆方向への輸送を担うキネシンと細胞質ダイニンの運動が適切に調節される必要がある。特に、小胞や目的地ごとに多種多様なキネシンが存在するのに対し、細胞質ダイニンは1種類でほぼすべての小胞輸送に対応するため、細胞質ダイニンの活性調節が輸送方向決定の鍵を握ると考えられている。この調節の分子機構として、最近、おもに構造学的な知見からダイニンの2つの重鎖が重なることによる自己阻害モデルが提唱された。しかし、細胞内において実際に自己阻害モデルの構造状態をとるのか、それが運動活性といかに連関するかという点については、明らかになっていない。
本研究は上記の問題を検証するため、ダイニン1分子中に存在する2つの重鎖それぞれを蛍光標識し、その蛍光物質間の共鳴エネルギー移動を利用して、運動中および休止中のダイニン分子の構造状態を精査するものである。平成30年度の研究によって、3種類の位置に蛍光標識したダイニン遺伝子組換え体の構築および発現に成功し、そのすべてが運動活性を保っており、野生型と同じく多様な運動状態を示すことを確認した。また、そのうち1種については標識ダイニンの分子内蛍光共鳴エネルギー移動を捉えることも成功している。今後は、捉えた蛍光共鳴エネルギー移動のシグナルと構造状態の連関を確認したうえで、各運動状態におけるダイニンの構造状態を調査していく予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究は、最終的に細胞内での輸送状況とダイニンの構造状態との連関を検証することを目的としている。そのためには、まずダイニンの構造状態に応じて蛍光共鳴エネルギー移動効率が大きく変化する位置に蛍光物質を付与する必要がある。
研究初年度にあたる平成30年度の研究によって、当初に計画した3か所の蛍光標識位置の候補すべてにおいて、ダイニン遺伝子組換え体の構築・発現・精製に成功し、予定していた蛍光標識ダイニン分子が得られた。さらに、実際の顕微鏡観察によって、得られた3種の蛍光標識ダイニンのすべてが微小管上を運動する活性を保持していることも確認できた。したがって、3種類の蛍光標識ダイニンを今後の研究に使用することができる状況が整い、蛍光標識による影響などを検証するうえで非常に有用であると期待できる。さらに、得られた蛍光標識ダイニンの1分子イメージングによって、蛍光共鳴エネルギー移動効率が経時変化している様子を捉えることに成功した。この蛍光共鳴エネルギー移動効率の変化とダイニンの構造状態の関係を実証していくことが必要にはなるが、これまでに得られた蛍光標識ダイニンを用いれば運動活性と構造状態の同時観察が可能になるものと強く期待できる結果である。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後の研究の方針としては、まず平成30年度の研究で得られた蛍光標識ダイニンの、蛍光共鳴エネルギー移動効率とダイニン構造状態との関係性について、自己疎外モデルで想定されている2つの重鎖が重なる構造状態を取れなくなる変異体を用いた実験や、クライオ電子顕微鏡観察など、多方面から検証していく。この検証を通じて、各蛍光共鳴エネルギー移動効率と対応したダイニンの構造状態を確定していく予定である。
以上の検証が完了しだい、細胞質ダイニンの2つの重鎖の向きが、運動活性や細胞内輸送方向へ与える影響を調べるために、細胞内の内在性ダイニン重鎖に蛍光タンパク質をノックインする。上記の検証で有用な蛍光標識位置と確定した箇所に、CRISPR-Cas9ゲノム編集システムを用いて、遺伝子操作することを予定しており、すでに良好な予備データを得ている。細胞質ダイニンのノックアウトは致死であるた
め、従来、細胞内でのダイニンへの遺伝子操作は非常に困難であった。しかし、近年のゲノム編集技術の発展に伴い、内在性ダイニン重鎖への蛍光タンパク質の挿入が可能となり、これを応用すればダイニンの構造状態のライブイメージングが可能である。
ノックインされた蛍光タンパク質の蛍光共鳴エネルギー移動効率を、生細胞イメージングにより計測することで、細胞内輸送時のダイニンの運動活性と構造状態の同時計測を実現し、輸送方向にも大きく影響する細胞質ダイニンの運動制御機構を明らかにしていく予定である。
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| Causes of Carryover |
蛍光共鳴エネルギー移動による実験方法論をまとめた論文が予定より早く完成し、その投稿料が必要になったことにより、物品費目で予定していた品目と購入できる品目に齟齬が生じたため。必要物品を購入することに使用する予定である。
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