2019 Fiscal Year Research-status Report
Na+ポンプによるNa+の選択機構の構造生物学的研究
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18K06148
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
金井 隆太 東京大学, 定量生命科学研究所, 助教 (50598472)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
恒川 直樹 東京大学, 定量生命科学研究所, 特任研究員 (90638800)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | Na+,K+-ATPase / 能動輸送 / 膜蛋白質 / X線結晶構造解析 / 脂質二重膜 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
Na+,K+-ATPaseによるNa+選択機構の解明を目的として、本年度は既に結晶が得られていたE1.nNa+状態の高分解能での構造決定のほか、塩の種類、濃度を変えて異なるイオンの結合構造の結晶化及び構造決定に取り組んだ。その結果、E1.nNa+状態の高分解能での構造決定については構造決定がほぼ終わり、確かに３個のNa+結合状態を確認することができた(E1.3Na状態)。また、3個のNa+の代わりに、1個のMg2+やMn2+結合状態も得ることができ、現在、最終的な構造精密化の途中である。さらに、結晶中のNa+濃度を段階的に減らすことにより、E1.1～2Na状態らしき構造も得ることができ、3個のNa結合の形成過程を明らかにできる可能性が出るなど、大きな進展が見られた。また、当初、想定していなかったE1.nNa+状態の結晶内の脂質二重膜の可視化について、予備実験をさらに進めたところ、histodenzを用いた溶媒コントラスト変調法および重原子クラスターを用いた重原子同型置換法にて一部の脂質二重膜の可視化に成功した。これにより、Na結合構造の詳細だけでなく、脂質二重膜との詳細な相互作用を解明できる見通しをつけることができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
本年度は既に結晶が得られていたE1.nNa+状態の高分解能での構造解析のほか、様々なイオンの結合状態の構造決定を目標とした。結果的にその目標をほぼ達成できただけでなく、3個のNa結合過程の中間状態の構造も得ることができ、当初、予想していなかった3個のNa結合過程の詳細を明らかにできる可能性が出てきた。また、いまだに謎が多い脂質二重膜との相互作用について、一部の脂質二重膜構造の可視化に成功し、予想以上の進展を得ることができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
引き続き、様々なイオン結合状態や1-2個のNa結合状態の最終的な構造決定を行う。また、当初予想していなかった脂質二重膜の可視化について、最終的には精度が十分高い回折データの収集が必要であり、本課題期間中での達成を目指して精力的に実験を行う。
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| Causes of Carryover |
イオンを解像できる分解能を得る、また様々なイオン結合状態を見るには結晶化に関連した様々な試行錯誤の実験が必要であることを想定し、費用を見積もっていた。しかし、意外にも分解能については回折データの異方性を補正することで大幅に改善し、また様々なイオン結合状態についてもNa存在下で得られた結晶を異なるイオンを含む結晶化溶液にソークするだけでいくつか得ることができるなど、想定以上に容易に達成することができた。
一方で、大幅な進展を見せた結晶内の脂質二重膜の可視化については通常よりも極めて精度の高い回折測定が必要であり、次年度では想定以上に多くの結晶化実験、回折測定が見込まれる。したがって、本年度使用しなかった分を次年度の研究費として使用する。
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