2019 Fiscal Year Research-status Report
1分子DNAのねじれ応答測定による弾性調節型インスレーター機能の検証
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18K06149
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| Research Institution | Tokyo University of Agriculture and Technology |
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Principal Investigator |
村山 能宏 東京農工大学, 工学(系)研究科(研究院), 准教授 (60334249)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
坂本 尚昭 広島大学, 統合生命科学研究科(理), 准教授 (00332338)
粟津 暁紀 広島大学, 統合生命科学研究科(理), 准教授 (00448234)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | DNA / インスレーター / ねじれ / 弾性 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
インスレーター（Ins）と呼ばれるDNA上の特定の配列は，染色体に散在する無数の遺伝子の転写調節の謎を解く鍵と考えられている。本研究では，ArsInsや反復配列等の蛋白質の結合なしにIns活性を示す配列に着目し，これらの配列がDNAの力学的変形を調節する弾性調節型Insとして機能するのか検証することを目的としている。
2019年度は，前年度に作成に成功したGFP遺伝子と1つのエンハンサー(Enh)を含む約7 kbpのDNA試料（試料1）と試料1の一部をArsIns (578 bp)に置き換えた試料（試料2）を用いて，1分子DNAのねじれ応答（DNAをねじった回数と末端間距離の関係）の観測を行った。その結果，配列と力学的変形の相関を検証するためには，0.6-0.8 pNの張力下において，1 Hz程度の回転周波数で連続的にねじることが有効であることを突き止めた。また，ねじれ応答を観測するための試料作成において，ガラス基板の前処理方法，ガラス基板およびビーズのコート方法の改良を行い，従来よりも短時間，高効率で試料を作成する方法を開発した。
また，ArsInsの物性と比較する対象となるヌクレオソーム形成能の高いDNA配列であるWidom601配列の物理的性質を，標準的なヒストン８量体ではなく２つのヒストンが欠けたヘキサソームヌクレオソームの構造安定性をシミュレーションする事により考察した（Kameda, et al., 2019）。さらに，in vitroヌクレオソーム再構成系を用いてArsInsにより形成されるヌクレオソームの特性を解析したところ，Widom601と比較してArsInsではDNAの巻き付きの緩いヌクレオソームが形成されることが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
ArsInsの力学的寄与を明らかにするにあたり， GFP遺伝子と1つのエンハンサー(Enh)を含む約7 kbpのDNA試料を用いてねじれ応答の観測を行っている。実際にいくつかのねじれ応答は測定できているものの，試料作成過程において，DNAのガラス基板及びビーズ表面への非特異吸着を抑制させる必要が生じた。この問題を克服するにあたり，ガラス基板のプラズマ洗浄及びビオチン修飾BSAによるコートの有用性を確認した。現在，改良した試料作成方法を用いて，ArsInsの有無とねじれ応答の相関関係を得るための測定を継続している。
また，粗視化DNAモデルを用いたArsInsC配列，Widom601配列，各種３塩基リピート配列のシミュレーションにより，各配列の揺らぎの特徴の違い，曲げに依る屈曲応答の違い，ヌクレオソーム結合字の形状の安定性の違いを評価し，各配列の力学物性の考察を続けている。
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| Strategy for Future Research Activity |
ねじれ応答については，継続してArsIns挿入試料を対象として測定を行う。改良した試料作成方法を用いてDNAの非特異吸着を抑制することにより，ねじれ応答取得の効率化を図る。また，ArsInsの力学的寄与をねじれ応答から明確に検証することができなかった場合を想定し，同一試料を用いたAFM観測を並行して実施する。力学的負荷がない状態でのDNAのAFM画像から，DNAの弾性を特徴づける持続長を算出し，ArsInsの有無と持続長の関係を示す。さらに，末端間距離や慣性半径を算出することにより，ArsInsの有無という局所的な配列の違いが，DNAの大域的な構造変化に及ぼす影響を定量的に示す。
また，粗視化DNAモデルを用いた各種配列の力学応答の評価，及びその両端に遺伝子制御配列を繋げた際の，その両側の配列の挙動を考察し，実験でみられるインスレーター活性の描像化を進める。
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| Causes of Carryover |
2019年度末に参加を予定していた日本物理学会の現地開催が，新型コロナウイルスの影響により中止となり，次年度使用額（133,242円）が生じた。ねじれ応答測定において，試料作成方法の改良と実験回数の増加にともない，試薬使用量の増加が見込まれているため，これらの購入費に充当する予定である。
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