2018 Fiscal Year Research-status Report
ホモダイマー型光合成反応中心に存在するキノン分子の特異な電子移動反応の解明
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18K06153
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
大岡 宏造 大阪大学, 理学研究科, 准教授 (30201966)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
熊崎 茂一 京都大学, 理学研究科, 准教授 (40293401)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 光合成 / 反応中心 / 電子移動 / キノン / FTIR / 超高速分光 / ヘリオバクテリア / 緑色イオウ細菌 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
１．ヘリオバクテリア反応中心の結晶化・構造解析：米国グループが2017年に高分解能構造解析（2.2オングストローム、空間群C2）に成功し、二次電子受容体キノンが存在しない構造を報告した。一方我々は分解能が低いながらも異なる空間群の結晶（R32）が得ることでき、結晶構造中にはキノン分子の存在を示唆する電子密度が確認できていた。そこで高分解能を目指してスクリーニング方法や凍結方法などの改良を試みたところ、ようやく目標にしていた分解能にほぼ到達し、現在、詳細な解析を進めている。
２．緑色イオウ細菌反応中心の結晶化を目指した標品調製：これまでコアタンパクにHisタグを付加した反応中心複合体を可溶化後、Ni樹脂によるアフィニティ精製を行っていた。しかしながらアフィニティ精製の途中で複合体を構成するサブユニット（FMOタンパク、PscBタンパク、PscDタンパクなど）が解離（脱離）しやすいことが問題であった。そこで結晶化用には均一な標品を調製する必要があり、これまでの精製方法の改良を行った。その結果、明所下の操作では構成サブユニットが脱離しやすいが、dim-light下で精製することより、ほぼ脱離を防ぐことができた。またフラッシュ照射実験で活性を評価したところ、dim-light下での精製標品ではP800+FA/FB-の電荷再結合に由来する半減期100msの減衰成分が約3倍に増大していた。高い活性を保持した標品を調製することに成功した。
３．緑色イオウ細菌反応中心のPscBタンパク（FA/FBタンパク）の大量発現系構築と精製：pscB遺伝子を大腸菌発現用のpETベクターに組み込み、ISC遺伝子群（鉄硫黄クラスター形成に関与）との共発現系を構築した。アセトン処理によりクラスターを保持したPscBタンパクを水溶性画分に回収できたが、凝集しやすいために最終精製標品を得ることができなかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
ヘリオバクテリア反応中心の結晶化・構造解析については、当初の想定以上の結果が得られ、順調に進んでいる。研究実績の概要で触れているが、目標とする分解能に達することに成功し、投稿に向けて鋭意努力している。特に我々の構造データ中には、長く議論の的となっていた二次電子受容体キノンを見いだすことに成功している。キノン分子が関与する反応については、これまで常温の過渡吸収では測定されていない。未知の電子移動反応・経路が存在している可能性も含め、今後さらなる分光学的解析が必要となってきた。
一方、光駆動反応によるキノン還元（キノール生成）反応をフーリエ変換赤外分光（FTIR）により検出する試みを実施したが、結果はネガティブであった。米国のアリゾナグループ（Kevinら）は強いパルスレーザー光を連続的に照射しているため、人工的なキノール生成を検出している可能性がある。
また緑色イオウ細菌反応中心の結晶化をスタートさせる予定であったが、今年度の計画を推し進めていく実験途中で、複合体を構成するサブユニット（FMOタンパク、PscBタンパク、PscDタンパクなど）が解離（脱離）しやすいことに気付いた。そこで様々な精製改良を試みたところ、明所下の操作では構成サブユニットが脱離しやすいが、完全暗所で操作すれば脱離を防ぐことが可能であった。現在は最小限の光強度に絞った緑色光（dim-light）下での操作で、再現性よく活性の高い均一な標品が得られている。
さらに緑色イオウ細菌反応中心のPscBタンパク（FA/FBタンパク）の生化学的・物理化学的性質を調べるために、大腸菌を用いた大量発現系の構築を行った。菌体を破砕後、どうしても沈殿画分に回収されるため、様々な可溶化方法を試みた。最終的にアセトン処理によりクラスターを保持したPscBタンパクを水溶性画分に回収することができたが精製には至らなかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
ヘリオバクテリア反応中心のキノン（A1）結合部位周辺の分子環境解析：ヘリオバクテリア反応中心の結晶構造中に見いだされたキノン分子はArg554残基とπ-π相互作用する強い結合であった。キノン結合部位周辺の分子環境を探るにはFTIR法が適していると考え、膜標品を調製し、光照射を行うことでキノールの生成の検出を試みたが期待通りの結果は得られなかった。次年度は光照射条件を変えてみるとともに、Arg残基を15N置換、あるいは重水素（D2O）化することで、光照射前後のスペトル変化をFTIRにより測定することを検討する。
緑色イオウ細菌反応中心のキノン結合部位への変異導入と過渡吸収測定：緑色イオウ細菌反応中心ではArg 638（ヘリオバクテリアでは上記のArg554）に相当する。すでに他のアミノ酸残基（Lys/His/Glnなど）に改変した株の作成に着手している（立命館大学・浅井智広講師との共同研究、未発表）。株の構築後、分光学的測定を行う予定である。また過渡吸収測定のためにナノ秒レーザーを設置した。現在、サブミリ秒範囲の測定が可能であるが、今後の測定のためにはサブマイクロ秒範囲の測定が可能な装置へと改良していく必要がある。
緑色イオウ細菌反応中心の結晶化：精製途中で複合体が解離しやすいことが問題であったが、dim-light下（ほぼ暗所下）では安定な複合体標品が調製できることが確認できている。X線結晶構造解析とともにクライオ電子顕微鏡による構造解析に挑戦していく予定である。
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| Causes of Carryover |
（理由）現在までの進捗状況で述べたように、今年度は可溶化、精製法の改良に時間を費やし、大量に標品調製することがなかった。そのため界面活性剤の使用頻度が低く、在庫で十分であり、新たに購入することはなかった。その他、精製に必要なNi樹脂の購入をしなかった。これらの理由により、次年度の予算使用額が生じた。
（今後の使用計画）次年度の研究遂行に必要とされる試薬類の購入費として使用予定である。
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