2018 Fiscal Year Research-status Report
Single molecule measurement of ligand bindings to the acetylcholine receptor channel
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18K06157
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| Research Institution | Okayama University |
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Principal Investigator |
井出 徹 岡山大学, ヘルスシステム統合科学研究科, 教授 (60231148)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 1分子計測 / イオンチャネル / 単一チャネル電流計測 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は要素技術の開発、即ち装置の開発・改良を主眼に研究を推進した。
１分子蛍光計測と単一チャネル電流記録を同時に可能とすることが目的である。これまでの研究成果（Okuno et al. Nanoscale 2018など）をもとに、要素技術の改良と装置全体の整合を行った。
ⅰ）光学系（単一チャネル電流記録法と金属増強蛍光計測の融合）：局在プラズモン共鳴を利用した膜蛋白の1分子観察用蛍光顕微鏡を作製した。但し、イメージング（走査）の必要はないので、レーザ照明の導入、及びプローブ操作系の開発のみ行った。電気測定用人工膜系に適用するために、プローブはステッピングモータを用いたマニピュレータに固定し、数cmに及ぶ大きな動きからマイクロメートルレベルの微小な動きまで可能となるようにした。ⅱ）プローブ（電極）：本研究では、金属電極表面に固定したチャネル蛋白を直接人工膜に挿入する新しい電流計測法を用いている。この方法は最近我々が開発した方法で（Okuno他, Anal.Sci 2016）、先行研究が無いため試行錯誤しながら、①電極先端の形状、②表面修飾法、③チャネル蛋白の固定法等の測定条件を最適化した。また、本研究では電極先端が鋭利であることによる蛍光増強を利用する。このため、電極先端の曲率半径が100nm程度以下であることが求められる。①金線の電解研磨法、および②金ナノロッドを利用した1分子イメージングに付き、上述の人工膜への蛋白挿入法と併せて、最も効率が高い電極形状、表面修飾法を探索した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究は申請時の計画通りに進行している。
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| Strategy for Future Research Activity |
前年度の結果をもとに、チャネル-リガンド相互作用の1分子計測実験系の開発を行う。続いて、次年度以降にはアセチルコリン受容体チャネルとリガンドとの相互作用を１分子計測し、蛋白の状態遷移モデルを提案する。
１）チャネル-リガンド相互作用の計測：蛍光分子は電極先端からの近接場光によって励起される。すなわち、電極先端近傍のみが照明されるため、蛍光性の制御因子は蛋白と結合したときのみ輝点として計測される。初めにモデル系として溶血毒（aHL）と蛍光標識阻害剤との相互作用を1分子イメージングすることを試みる。これによって実験条件を最適化し、次に蛍光性リガンド（IC5-アシルコリン）とAChRチャネルの相互作用を１分子同時計測する。リガンド結合のタイミング（‘結合’後すぐにチャネルが活性化されるのか？）、個数等に関する詳細な情報を得る。
２）詳細な状態遷移モデルの検討：AChRチャネルは、最も詳細に分子メカニズムが調べられているチャネルの一つで、これまでの電気生理学、構造解析等から、詳細（複雑）な状態遷移モデルが複数提案されている。上記の計測結果をもとに、これらのモデルを検討し、新たな遷移モデルを提案する。
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| Causes of Carryover |
理由：予定していた試薬類（主にタンパク発現用細胞）の納入時期が遅れ、チャネル蛋白の発現に関わる研究計画が１ヶ月程度遅延したため、これに係る消耗品費、旅費等を次年度使用とした。
使用計画：計画の遅延は軽微であり、次年度（繰越）使用額は当初の予定通りの目的に使用する。次年度請求分も当初計画通り執行する予定である。
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