2019 Fiscal Year Research-status Report
Single molecule measurement of ligand bindings to the acetylcholine receptor channel
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18K06157
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| Research Institution | Okayama University |
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Principal Investigator |
井出 徹 岡山大学, ヘルスシステム統合科学研究科, 教授 (60231148)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | イオンチャネル / １分子計測 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
昨年度に引き続き、要素技術の開発、即ち装置の開発・改良を行った。また、１分子計測用に変異体チャネルの発現精製を実施した。
１分子蛍光計測と単一チャネル電流記録を同時に可能とすることが目的である。これまでの研究成果をもとに、要素技術 の改良と装置全体の整合を行った。
ⅰ）光学系（単一チャネル電流記録法と金属増強蛍光計測の融合）：局在プラズモン共鳴を利用した膜蛋白の1分子観察用蛍光顕微鏡を作製した。昨年度までに、装置は概ね完成していたが、計測がより容易になるように、新たに電動微動マニピュレーターを組み込み、大幅に装置を改造した。
ⅱ）プローブ（電極）： 本研究では、金属電極表面に固定したチャネル蛋白を直接人工膜に挿入する新しい電流計測法を用いている。昨年度に引き続き、試行錯誤しながら電極先端の形状等の作製条件を改良した。昨年度までは、専ら先端が鋭利な金線を蛍光増強に利用してきたが、電極先端を再現することが難しいため、市販の金属ナノ粒子（金ナノロッド等）の使用も検討した。ナノ粒子上への蛋白の固定法、ナノ粒子による蛍光増強を起こす条件等を検討した。
また、副次的な成果として、上記の電流計測法を用いたイオンチャネル蛋白の高効率測定装置の開発も手がけた。固体、あるいは親水性ゲル表面に固定したチャネル蛋白を透過するイオン性電流を高効率で測定する自動計測装置の開発に成功した。装置は、上記の１分子計測装置の転用であり、これを並列多チャンネル化することにより、いわゆるハイスループットスクリーニング装置の作製を進めている。さらにこれらの測定法を用いて、蛋白毒が作るイオンチャネルの解析も行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究は概ね申請時の計画通り進行しており、副次的な成果も得られている。
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| Strategy for Future Research Activity |
前年度の結果をもとに、チャネル-リガンド相互作用の1分子計測実験を行う。次年度後半以降にはアセチルコリン受容体チャネルとリガンドとの相互作用を１分子計測し、蛋白の状態遷移モデルを提案する。 １）チャネル-リガンド相互作用の計測：蛍光分子は電極先端からの近接場光によって励起される。すなわち、電極先端近傍のみが照明されるため、蛍光性の制 御因子は蛋白と結合したときのみ輝点として計測される。初めにモデル系として溶血毒（aHL）と蛍光標識阻害剤との相互作用を1分子イメージングすることを試みる（既に計測を開始している）。これによって実験条件を最適化し、次に作製中の蛍光性リガンドとAChRチャネルの相互作用を１分子同時計測する。リガンド結合のタイミング（‘結合’後すぐにチャネルが活性化されるのか？）、個数等に関する詳細な情報を得る。 ２）詳細な状態遷移モデルの検討：AChRチャネルは、最も詳細に分子メカニズムが調べられているチャネルの一つで、これまでの電気生理学、構造解析等から、 詳細（複雑）な状態遷移モデルが複数提案されている。上記の計測結果をもとに、これらのモデルを検討し、新たな遷移モデルを提案する。
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| Causes of Carryover |
培養細胞の入手遅延により、関係する試薬、消耗品の支払いが遅れたため。
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