2021 Fiscal Year Research-status Report
Single molecule measurement of ligand bindings to the acetylcholine receptor channel
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18K06157
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| Research Institution | Okayama University |
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Principal Investigator |
井出 徹 岡山大学, ヘルスシステム統合科学学域, 教授 (60231148)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | イオンチャネル / 1分子計測 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は１分子蛍光計測と単一チャネル電流記録を同時に可能とすることである。前年度までの研究成果をもとに、引き続き要素技術の改良と装置全体の整合を行った。
i）プローブ（電極）：本研究では、金属電極表面に固定したチャネルタンパクを直接人工膜に挿入する新しい電流計測法を用いている。昨年度に引き続き、試行錯誤しながら電極先端の形状等の作製条件を改良した。これまでに、金あるいは銀線を電気化学的に研磨し、先端を鋭利（先端曲率半径<100nm）にすることによって蛍光増強に利用してきたが、安定して同一形状のプローブを作製することが極めて難しい。そのため、昨年度に引き続き研磨条件（プローブの材質・サイズ、研磨溶液、印加電圧など）を検討した。これにより、プローブの「歩留まり」はやや改良された。
ⅱ）チャネル組込法：人工膜へのチャネル組込効率を上げるため、膜小胞に再構成したチャネルタンパクをプローブに固定し、膜融合を利用して人工膜に挿入する方法を開発した。これにより、チャネルタンパクの人工膜への組込効率が著しく向上した。
ⅲ）副次的な成果として、昨年度に引き続き上記の電流計測法を用いたイオンチャネルタンパクの高効率測定装置の開発も手がけた。親水性ゲル表面に固定したチャネルタンパクを透過するイオン性電流を高効率で測定する自動計測装置の開発に成功した（上記膜融合法を取り入れることにより、昨年度よりも測定効率が高まった）。これらの測定装置を用いて、土壌細菌によるタンパク毒（Bacillus thuringiensisによるCryToxin）のイオン透過性を解析した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
感染症流行によって目的タンパクの精製が不可能であったため。
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| Strategy for Future Research Activity |
チャネル-リガンド相互作用の1分子計測実験を行う。年度後半以降にはアセチルコリン受容体チャネルとリガンドとの相互作用を１分子計測し、蛋白の状態遷移モデルを提案する。 １）チャネル-リガンド相互作用の計測：初めにモデル系として溶血毒（aHL）と蛍光標識阻害剤との相互作用を1分子イメージングすることを試みる（一部計測済み）。これによって実験条件を最適化し、次に作製中の蛍光性リガンドとAChRチャネルの相互作用を１分子同時計測する。リガンド結合のタイミング、個数等に関する詳細な情報を得る。２）詳細な状態遷移モデルの検討：上記の計測結果をもとに、これらのモデルを検討し、新たな遷移モデルを提案する。
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| Causes of Carryover |
感染症流行のため、試料の生成が出来ず研究の進捗に遅れが生じた。そのため期間延長申請を行った。
試料を精製し、当初の計画通りチャネルタンパクとリガンドとの相互作用を１分子レベルで観測する。次年度使用額は主にタンパク試料の精製に充てる。
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