2018 Fiscal Year Research-status Report
Spatiotemporal mechanism in T cell signaling regulated by cell membrane dynamics
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18K06165
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| Research Institution | Tokyo Medical University |
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Principal Investigator |
町山 裕亮 東京医科大学, 医学部, 講師 (40704606)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 分子イメージング / T細胞 / シグナル伝達 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的はT細胞活性化メカニズムにおいて抗原提示細胞との接着面における細胞膜の構造ダイナミクスとT細胞シグナルネットワークとの関連を調べることにある。T細胞シグナルのダイナミクスを観察するために1分子蛍光追跡の実験系の確立を行った。観察対象のシグナル分子にHalo-tagを付加したコンストラクトをレトロウイルス感染によりT細胞に発現導入した。観察前にStella650ラベルしたHalo-tagリガンドを1 nM加えて蛍光ラベルしたT細胞を平面脂質膜上にのせて接着面を観察した。T細胞活性化の指標となるTCRマイクロクラスターを同時観察することにより、シグナルの惹起とシグナル分子の動態を関連付けられるようになった。T細胞シグナルの最上流にあるLckキナーゼを観察したところ、TCRマイクロクラスターの外では自由拡散していた。一方で、TCRマイクロクラスター内では停留する時間が長くなった。この結果はLckによるTCRシグナルの惹起する現象と合致しており、本実験系の正当性を示唆する。T細胞シグナルに関連する様々な分子のコンストラクトは完成しており、完成した実験系を用いて観察を行う。
T細胞にはCD4陽性T細胞とCD8陽性T細胞に大別されるものの、T細胞シグナルについて両細胞間に違いはないと想定されているが、確定的な証拠は見つかっていない。本研究では、シグナル分子のダイナミクスの視点からCD4陽性T細胞とCD8陽性T細胞の相違点を議論することで一歩進んだ生物学的意義を見出していく。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の計画通り、T細胞シグナルに関連するシグナル分子のダイナミクスが計測できる実験系が確立できた。蛍光色素の選択、染色方法などのサンプル作りやレーザー強度、カメラ露光時間などの顕微鏡のセッティングの最適化も行い、30秒程度の長時間の1分子観察できるプロトコルを確立した。一分子観察のデータ取得が簡便になった一方で、解析に多大な時間が費やされていたので、購入した2台のPCを活用して解析時間を分散させることである程度軽減された。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度は細胞膜のダイナミクスを観察する実験系の確立を最優先させる。研究計画では光活性化型蛍光たんぱく質を用いて3次元超解像イメージングを行うことを計画していたが、これと並行してより高さ方向への感度が高いと考えられる偏光特性を利用した実験系も試していく。具体的には偏光特性のある蛍光色素で細胞膜を染色して90度異なる方向から直線偏光のレーザーを照射することで偏光面の変化から膜の構造変化を観察する。
現在、研究の進展を妨げている点として、解析時間が長時間に及ぶことが挙げられる。多くの部分を手作業で解析しており、解析ソフトを利用して自動化することで解析時間のさらなる軽減を行う。
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| Causes of Carryover |
当初は1台のカメラで2画像を取得する予定であり、視野を広くするために低倍率の対物レンズの購入を予定していた。しかし、2台のカメラで画像取得が可能となり、現有の高倍率の対物レンズを用いても十分な視野が確保できたため、購入を見送ったことが次年度使用額が生じた理由である。
画像取得が容易になった一方で、手作業で行う解析に費やす時間が膨大になりつつある。より多くの情報を取り出すためには、フリーソフトの画像解析アプリケーションでは対応できな部分も多くなってきた。複雑な計算にも対応できる画像解析ソフトを購入することで上記の問題点の解決していく予定である。
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