Function analysis and modification of photoactivaated adenylyl cyclases aimed at generating a novel optogenetic tool

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K06166
• Research Institution: Toho University
• Principal Investigator: 伊関 峰生 東邦大学, 薬学部, 教授 (60414009)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: 光センサー / アデニル酸シクラーゼ / cAMP

Outline of Annual Research Achievements

本研究は、光で活性化されてcAMPを産生する特異なタンパク質、光活性化アデニル酸シクラーゼ（PAC）の機能改変および新規類似タンパク質の機能解析を進めることにより、オプトジェネティック・ツールとしての有用性を高めることを目指すものである。最近結晶構造が解明されたシアノバクテリア由来PAC（OaPAC）に対して変異導入あるいはドメイン交換を行うことにより、活性化キネティクスや基質特異性の変化したタンパク質の創出を行う。同時にゲノムデータ上に存在するPAC類似遺伝子について、アデニル酸シクラーゼ欠損大腸菌株を利用した機能解析と精製タンパク質の分光学的、酵素学的解析を網羅的に進め、新しいツールの素材を探索する。
1. PACの機能改変
これまでにOaPACおよびスピロヘータ由来PAC（TpPAC）に対するドメイン交換および変異導入によって光活性化グアニル酸シクラーゼへの変換を試みたところ、グアニル酸シクラーゼ活性の検出には成功したものの、まだその光制御は不十分である。
2. PAC類似遺伝子の機能解析
これまでに5種類の新規PAC類似遺伝子を対象にアデニル酸シクラーゼ欠損大腸菌株の機能相補実験を行ってきたが、意外にもそのうち3種類は全く大腸菌では機能しないことが明らかになってきた。現在、その原因について追究している。今後さらに対象遺伝子を増やし、それらの活性制御の特性を明らかにすることにより、有用なツールの探索を進めるとともに、PACの進化系統について考察を深めていく。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

光活性化アデニル酸シクラーゼの発現ベクター構築、機能相補実験の作業はこれまでの経験でほぼルーチン化されており、大きな困難には直面しなかった。

Strategy for Future Research Activity

PACの機能改変については、TpPACが有用な材料となることがわかったので、これを対象にしてさらに変異導入を行い、実用的な光活性化グアニル酸シクラーゼの完成を目指す。新規PAC類似遺伝子の機能解析はさらに候補を広げて有用なツールを探索するとともに、酸化還元酵素触媒ドメインを持つNaPACについては大腸菌で発現させたタンパク質を用いてin vitroでの機能解析を進める。

Causes of Carryover

（理由）当初計画では初年度に振とう培養機を新規購入する予定であったが、学内の管理替によって導入できたため、購入の必要がなくなった。
（使用計画）次年度は酵素活性測定のためのエンザイムイムノアッセイキット等、高価な試薬を多用するほか、多くの新規PAC類似遺伝子の人工合成も行うため、すべて消耗品として支出する予定である。