2018 Fiscal Year Research-status Report
偏光と超高解像度顕微鏡でアクチン線維が張力センサーとして働くメカニズムを解明する
| Project/Area Number |
18K06167
|
|---|
| Research Institution | Kanazawa Institute of Technology |
|---|
Principal Investigator |
辰巳 仁史 金沢工業大学, バイオ・化学部, 教授 (20171720)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
|
| Keywords | アクチン線維 / 力学受容 / 機械刺激 / 一分子 / 蛍光 / 偏光 / 顕微鏡 / 量子ドット |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
本研究ではアクチン線維による力学刺激受容の分子機構を調べる。コフィリンが結合したアクチン線維は捻れていることが電子顕微鏡の観察から知られている。我々は逆転的な発想により以下のような仮説を提案した。すなわち”アクチン線維は線維の長軸方向に常にねじれており、ねじれが大きい時にコフィリンの結合部位がアクチン線維の表面に現れてコフィリンの結合とアクチン線維の切断が起きるが、アクチン線維の張力が大きくなった時にはこのねじれのゆらぎは抑えられてコフィリンの結合が抑制される”と考えた。アクチン線維内の張力が増すとアクチン線維のねじれのゆらぎの振幅が小さくなることを示すことができた。しかしこの実験データからはアクチン線維全体でのねじれの変化を知ることができるが、上記の仮説を検証するために必要なデータを得ることはできない。すなわちアクチン線維においてねじれが自発的に発生する位置やタイミング、またねじれの発生した部分に実際にコフィリンが結合すること、そしてねじれの発生が張力によって抑制され、それに伴ってコフィリンの結合が抑制されることである。
これまでの張力受容する分子の研究では力によって張力受容分子の形が単に歪むことが力学受容機構であると想定されてきた。本研究では分子の自発的なゆらぎの振幅などの減少（ねじれゆらぎの多様なモードの変化：後述）が力学受容の分子機構であるとする点で独創的である。これまでアクチン線維のねじれの大きさの評価は行われてきたが、ねじれのゆらぎの出現場所やゆらぎのモードの変化については研究が行われてこなかったので、学術的独自性は高い。そのためにアクチン線維を独自の偏光顕微鏡の観察面に緩やかに固定して観察する。研究の目的はアクチン線維のねじれが起きている部分を正確にイメージングし、アクチン線維の張力が高まるとねじれの自発的な形成は抑制されることを示す。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
球状のタンパク質分子であるGアクチンを試験管の中で“重合”させると、数μmから数十μmのアクチン線維ができた。本研究ではアクチン線維一本をガラスカバーグラスに弱く結合させて、アクチン線維のねじれの様子をアクチン線維全長に渡って詳細に分析しつつある。アクチン線維のねじれを評価するためにアクチン線維を蛍光分子ローダミンで標識した。ローダミン分子はその方向に依存した偏光を発する。この偏光の向きをそのままCCDカメラで撮影しても偏光の変化を記録することはできない。そこで偏光の向きに従って光の屈折が変化する方解石プリズムをCCDカメラの前にセットした。方解石プリズムは偏光の向きに従って画像を二組に分ける。予備実験を行った結果、これら二組の画像をCCDカメラで記録することができた。アクチン線維がねじれると二つの偏光の強さが入れ替わるように変化することが予想される。偏光の強さが時間とともに入れ替わることが観察され、アクチン線維が長軸に沿って自発的にねじれを生じていることが分かった。これらの動画の詳細分析を行うと、アクチン線維は、それぞれの場所で個々に独立にねじれ運動をしているだけではなく、興味深いねじれの協同現象が見られた。時にはねじれは同じ場所で繰り返すことが見られ、詳しく見るとひと続きのアクチン線維の一部が同時に大きくねじれる場合や、ねじれがアクチン線維に沿って数ミクロンに渡って伝播していく様子も捉えられ、多様なモードの存在が示唆された。ビーズをアクチン線維に結合し光ピンセットにより牽引することで、アクチン線維の多様なねじれのモードの内のどのモードが張力に大きく影響を受けるかを検討し、張力受容において重要な役割を持つねじれのモードを確定する準備ができた。
|
| Strategy for Future Research Activity |
蛍光標識したコフィリンをアクチン線維に投与して張力の発生しているアクチン線維にはコフィリンの結合が抑制されることを確認する準備を進めている。逆に張力を弱めたアクチン線維では自発的なねじれの位置にコフィリンの結合が起きることを確認する予定である。上記の結果は大変興味深いものとなる予定だが、ローダミン分子の蛍光の偏光面の変化に頼った解析になっている。ローダミン分子の周囲の疎水環境が蛍光に影響するので、アクチン分子全体の動きをローダミンの蛍光の偏光面の変化が正確に捉えていない可能性もある。研究ではローダミンと同時に発光粒子量子ドットによるアクチン線維の標識も行った。量子ドットの発光は通常偏光性を持たないが、長波長タイプの量子ドットに限っては強い偏光特性があることが判明した。アクチン線維に量子ドットを結合させると、アクチン線維のねじれに従って偏光面の変化を測定できる。ローダミンの偏光面の変化とともに近傍に結合している量子ドットの偏光面の回転を評価することでアクチン線維のねじれの測定をより確実にすることができつつあり、今後もこの方向で研究を推進する予定である。
|
| Causes of Carryover |
蛍光分子によるアクチン分子のラベル率の計測が必要になる可能性があり、蛍光分光光度計の選定が必要となった。また、研究の進展とともに選定機種が決まる。この様な事情から次年度使用額に上記の額を計上した。
|
