2018 Fiscal Year Research-status Report
ヘリカーゼの多量体形成・DNA巻き戻し機能・化学力学共役機構の相関関係の解明
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18K06169
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| Research Institution | The Graduate School for the Creation of New Photonics Industries |
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Principal Investigator |
横田 浩章 光産業創成大学院大学, 光産業創成研究科, 准教授 (90415547)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | １分子計測 / ナノバイオ / 核酸 / 酵素反応 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
多くのタンパク質で見られる多量体形成は、タンパク質の活性制御などに重要な役割を果たす。代表研究者は非六量体型スーパーファミリー1ヘリカーゼUvrD が多量体を形成してDNAを効率的に巻き戻すことを明らかにした。しかし、2分子目のUvrDのDNAへの結合がどのようにDNA巻き戻しをトリガーするのか、多量体を構成する個々のUvrDがATP加水分解エネルギーをどのように使ってDNA巻き戻しをしているのかの詳細は不明である。
そこで本研究ではUvrD のDNA上での多量体形成・DNA巻き戻し機能・ATP加水分解エネルギーの化学力学共役機構の相関関係を蛍光1分子イメージングすることで明らかにすることを目指している。
平成30年度は、多量体を形成できないとされるC末端アミノ酸欠損変異体および高いDNA巻き戻し活性をもつ変異体の蛍光1分子直視、多色同時蛍光1分子イメージング光学系の構築、DNA巻き戻しの1塩基分解能観察のためのDNA基質の準備を行った。
C末端アミノ酸欠損変異体の蛍光1分子直視については、過去の報告に反し多量体でDNAを巻き戻すことを明らかにした。また、そのDNAへの結合・解離ダイナミクスを解析したところ、1分子目のDNAへの結合・解離速度は野生型UvrDと同等だったのに対し、2分子目のDNAへの結合・解離速度はともに野生型UvrDより数倍大きいことを明らかにした。この結果はC末端アミノ酸が多量体形成に重要であることを示唆している。高いDNA巻き戻し活性をもつ変異体の蛍光1分子直視については、ATPγS存在下で野生型より多くの分子を含む多量体を形成することを見いだした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
UvrD変異体の蛍光1分子直視、多色同時蛍光1分子イメージング光学系の構築、DNA巻き戻しの1塩基分解能観察のためのDNA基質の準備をほぼ予定通り遂行できたため。
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| Strategy for Future Research Activity |
野生型UvrDについては、DNA巻き戻しの1塩基分解能観察、ATPの蛍光1分子イメージングを行う。UvrD変異体については、高いDNA巻き戻し活性をもつ変異体について蛍光1分子直視を行う。そして、多量体を形成できないとされるC末端アミノ酸欠損変異体および高いDNA巻き戻し活性をもつ変異体双方について、DNA巻き戻しの1塩基分解能観察、ATPの蛍光1分子イメージングを行う。
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| Causes of Carryover |
DNA巻き戻しの1塩基分解能観察のためのDNA基質の作製に多くに時間を要したため、次年度使用額が生じた。今後は研究計画にそって使用する。
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Research Products
(4 results)
