2018 Fiscal Year Research-status Report

磁気受容蛋白質複合体の会合制御による構造機能相関の解明

Research Project

Project/Area Number	18K06174
Research Institution	National Institutes for Quantum and Radiological Science and Technology
Principal Investigator	新井栄揮国立研究開発法人量子科学技術研究開発機構, 高崎量子応用研究所東海量子ビーム応用研究センター, 上席研究員(定常) (00391269)
Project Period (FY)	2018-04-01 – 2021-03-31
Keywords	タンパク質 / 立体構造 / X線結晶解析 / X線小角散乱 / 円偏光二色性
Outline of Annual Research Achievements	カワラバトなどの網膜細胞に存在する青色光受容蛋白質クリプトクロム(Cry)と磁気受容蛋白質(MagR)によって構成される複合体は、地磁気程度の弱磁場にも応答、配向するという極めて稀な性質を有する。この性質のため、Cry/MagR複合体は動物の磁気感受性の原因物質の可能性があるとして注目されている。本研究では、蛋白質工学的技術を駆使することでCry/MagR複合体の会合を制御することにより構造解析や磁気的性質の定量的評価を可能化し、構造・機能相関を解明することを目的とする。得られる知見は、磁気が関与する動物行動を理解する分子基盤構築に資するとともに、磁気を使って分子配向や細胞挙動などを操作する新規技術開発やバイオ材料創製など、多くの技術革新に繋がると期待できる。 2018年度は、カワラバト由来MagRをコードしたベクターを作製し、大腸菌の遺伝子組換えを利用した同蛋白質の発現系と調製方法を構築した。また、構造解析や磁気的性質の定量的評価を困難化する要因と考えられるMagRの会合体形成の不均一性を改善し、単量体～二量体化した変異型MagRを分子設計・調製することに成功した。更に、円偏光二色性分析法を用いてMagRの溶液構造の特徴（二次構造含量や構造の熱安定性）を明らかにした。本研究により、カワラバト由来MagRの熱変性温度は鳥類の一般的な体温（40～42℃）よりも高温域にあることや、同蛋白質の立体構造は90℃で変性させても10℃に冷却すると速やかに巻き戻る高い熱可逆性を有することなど、同蛋白質の構造・物性に関する基礎的且つ新規的知見を得た。2019年度はX線結晶解析法・X線小角散乱法等を用いてMagRの分子構造をより詳細に明らかにするとともに、Cryの発現系と調製方法の構築を試み、Cry/MagR複合体試料を取得してその構造・物性の解明を目指す。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 本研究での成果創出のためには、①MagRの不均一な会合性を制御する技術の確立と、②安定な試料調製系の確立が不可欠である。2018年度は、カワラバト由来MagR関して①・②ともに成功した。更に、円偏光二色性分析法を用いてMagRの二次構造の特徴や構造の熱安定性を明らかにするなど、本研究を進めるうえで基盤となる重要な知見を得ることができた。
Strategy for Future Research Activity	MagRについてより詳細な構造情報を取得するために、X線結晶解析法やX線小角散乱法などによる検討が必要である。X線結晶解析を行うには、蛋白質結晶の作製が課題となる。そこで、現在、MagRの結晶化条件探索を実施している。また、カワラバト由来CryについてMagRと同様に大腸菌の遺伝子組換え発現系の構築を試みたが、不溶性の封入体としてCryが発現することが明らかになり、試料調製に成功していない。2019年度は封入体からのリフォールディングによるCryの調製を試みるとともに、カワラバト以外で磁気感受性を有する生物種（オオカバマダラ・ショウジョウバエなど）のCry/MagRの発現系・調製方法の構築なども試みて試料性状の改善の可能性を探る予定である。更に、蛋白質結晶が得られない場合はX線小角散乱法などにより構造情報を取得し、生体環境に近い溶液中でのCry/MagR複合体の構造・物性の解明を目指した研究の展開を図る。
Causes of Carryover	一部の実験機器（ガウスメーター等）は研究協力者の所有物を使用できることになったため、購入を中止した。また、X線結晶解析やX線小角散乱分析は2019年度以降に集中的に実施することになったため、必要となるPC及びソフトウエアの購入を2019年度に延期した。また、同理由により外部施設利用実験（放射光利用実験等）のための旅費の一部を2019年度に繰り越すことになった。一方、2019年度は、蛋白質試料を作製するための試薬類（合成DNA、酵素等）・消耗品類の追加購入やX線小角散乱実験用の試料セルの購入が必要となる。繰越金は、これら試薬類・消耗品類・試料セル・PC・ソフトウエア等の購入、及び、旅費に充てる。