Mechanism to drive the evolution of non self-recognizing loci controlling plant reproduction

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K06178
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 久保 健一 東京大学, 大学院農学生命科学研究科(農学部), 特任助教 (60403359)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: 自他識別 / 協調的非自己認識 / S-RNase型自家不和合性 / 分子進化 / 植物ゲノム生物学

Outline of Annual Research Achievements

植物の多くは自家不和合性という種内生殖障壁によって交配相手の自他を識別し、近親交配を回避している。ナス科植物ペチュニアの自家不和合性は、協調的非自己認識システムであり、自他識別の際の特異性は1つの雌ずい因子（S-RNase）と多数の花粉因子（SLF）をコードするS-遺伝子座のハプロタイプによって決定されている：S-RNaseは細胞毒性タンパク質として自己花粉管の伸長を阻害し、一方SLFはS-RNaseを認識・解毒するタンパク質として非自己由来S-RNaseを解毒して他殖を保証している。本研究の目的は、ペチュニアの自家不和合性システムの成立において必須の過程である、自他識別に都合の良い花粉因子のレパートリーを進化させてきた過程について明らかにすることであり、そのため、複数のハプロタイプのS-遺伝子座の配列構造を決定、比較検討することを目的としている。このS-遺伝子座は20 Mbほどの大きさが予想され、内部は遺伝子間の距離が長く、リピートに非常に富むため、これまでアセンブリができていなかった。本研究は、配列解析の手段としてロングリードの次世代シークエンス技術を採用し、初めてペチュニアのS-遺伝子座のde novoアセンブリを目指している点を特徴としている。
平成31年度―令和元年度の研究では、前年度に検討の上でペチュニアに合わせ独自に改良したDNA抽出法を用い、3つのS-ハプロタイプ（Sm-、S7-、S11-ハプロタイプ）についてホモの個体について高品質高分子量ゲノムDNAを得ることができた。当初のOxford Nanopore社のMinIONを用いる方針を変更し、PacBio社が最近提供を始めたSequel-IIによるロングリードシークエンスを行った。現在、得られたリードのde novoアセンブリを行っている。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

初年度において解析対象のS-ハプロタイプホモ化系統を作出し直し、さらにDNA抽出法を改良した成果として、推定平均鎖長が20 kb以上の品質のよいゲノムDNAを得ることができた。さらに、当初の予定ではOxford Nanopore社のMinIONを用いる計画であったが、昨年度からはPacBio社の新しいロングリードシークエンス技術であるSequel-IIを用いた受託解析が国内の業者においても利用可能となり、こちらのほうがエラー率が低いという情報を得たため、利用することにした。結果、それぞれのS-ハプロタイプについて、総塩基数およそ 5 Gb、総リード数 40万、平均リード長 13 kbのシークエンス情報を得ることができた。これはペチュニアゲノムのおよそ4倍程度なので、シークエンス深度はあまり深くはないが、Genetyx ATSQなどのソフトウェアを用いた予備的なアセンブリの結果、各S-遺伝子座を構成するS-RNase、および20前後存在するSLF遺伝子のそれぞれに対し、周辺100-800 kbの範囲を含むコンティグを得ることができた。ロングリードシークエンスは一般に品質が高くないが、Sequel-IIのエラー率は実際100 bpに1塩基程度の頻度で、ほとんどが1から数塩基の挿入・欠失であり、範囲内で重複しあう複数のリードを比較することでシークエンスの修正が容易に可能であった。実際、既知の配列との比較で比較的正確な配列を取得できていることも確認できた。

Strategy for Future Research Activity

昨年度の研究によって得られたシークエンスリードデータを用い、de novoアセンブリを進める。特にS-遺伝子座上に位置するS-RNase、SLF遺伝子を起点としたウォーキングにより、正確なアセンブリを進める。同時に、全ゲノム情報は自家不和合性に限らず今後のペチュニアの研究に有用なツールとなることが期待できることから、ゲノム全体についてもcanuなどの既存のソフトウェアを用いた自動アセンブリも行う。
これまでに得た予備的なアセンブリの結果、進化の過程においてS-遺伝子座の多様化およびSLFレパートリーの獲得に寄与したと考えられる挿入・欠失イベントに関する情報が得られつつある。しかしながら、先行してシークエンスした3つのS-ハプロタイプ（Sm、S7、S11）は、共通のSLFsを持つものの、実際にはあまり近縁関係になかったため、比較するには多型性が高すぎ、共通の構造や共通の変異イベントに関する情報が多くは得られなかった。そこで、次回はS11とかなり近縁のS11mや、互いにかなり近縁の関係にあるハプロタイプ、S17とSc2、あるいはS22とS22mについて、ロングリードシークエンスを行い、de novoアセンブリを行う予定である。

Causes of Carryover

自動でのde novoアセンブリを行う上で、現在所有するコンピュータでは能力不足が深刻であり、新規にコンピュータを導入することにした。また、追加でロングリードシークエンスを発注する予定である。
得られた情報を元に、S-遺伝子座の配列構造のハプロタイプ間での詳細な比較を行う。特に重視する試みとして、共通の花粉因子遺伝子（SLF）を共有する遺伝子座間で、共通SLFsの周辺配列に共通する構造上の特徴について抽出し、S-ハプロタイプ間での遺伝子交換が行われた領域を特定するとともに、その具体的な分子メカニズムを明らかにする。得られた結果を取りまとめ、遺伝子交換によってドライブされたS-遺伝子座進化の分子メカニズムについてモデルを考察し、国内外の学会における発表、および原著論文の投稿を通じ、成果の発表を行う。予算は、学会参加費用、論文原稿校閲および投稿費用にも使用する。