2018 Fiscal Year Research-status Report
人工染色体へのFXS脆弱部位の搭載とCGGリピート不安定化再現モデルの作製
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18K06183
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| Research Institution | Tottori University |
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Principal Investigator |
中山 祐二 鳥取大学, 研究推進機構, 助教 (40432603)
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2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 脆弱X症候群 / 人工染色体 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
家族性の知的障害である脆弱X症候群（以下、FXS：Fragile X syndrome）はトリプレットリピート病に分類される。罹患者は自閉症症状を併発することが多いため、難治性疾患であるFXSの病態・病因の解明は、本疾患のみならず神経変性疾患の病態解明ならびに治療戦略の開発のためにも重要な位置付けにある。FXSの責任遺伝子であるFMR1(Fragile X Mental Retardation 1)の5’非翻訳（UTR）領域に存在するCGGリピートは、正常、保因者、患者と長さが異なり、保因者の持つ100リピート程度を中心とした中程度のCGGリピートが母性伝播すると、一気に200リピート以上にまで伸長する。そのアレルを受け取った子孫（特に男児）では、FMR1プロモーターおよびCGGリピート周辺領域の高度のメチル化が誘導され、FMR1遺伝子の発現を抑制することで発症する。
本研究ではFXS発症の根本的病因であるこれらの一連のクロマチン動態を再現し解析するために、CGGリピート配列をコアとするFXS脆弱部位を機能的ヒト染色体領域として人工染色体上にクローニングし、FXS発症のエピジェネティックな分子基盤を明らかにするための真の細胞モデルを構築することを目指している。
初年度は、FXS脆弱部位を保持する人工染色体の構築のため、FXS保因者由来のヒトX染色体を保持するCHO細胞内において、FMR1遺伝子上流領域にCre/loxPシステムのためのloxP配列をCRISPR/Cas9系を用いて挿入する過程を進めてきた。現在、ターゲットベクターの導入と薬剤選択処理により得られた、loxP配列が挿入された候補クローンのスクリーニングを進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
CRISPR/Cas9系を用いた染色体改変のためにターゲットベクターを構築する必要があったが、FMR1上流領域はgene poorであり配列がリピート様の領域がほとんどである。そのためと思われるが、挿入するloxP配列を持つターゲットベクターを構築するに予想以上の手間と時間がかかった。現在、当該ベクターを導入して、loxP配列が挿入されたクローンをスクリーニングしているところであるが、まだloxP配列が挿入されたクローンが取得できていない。
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| Strategy for Future Research Activity |
本研究はFXS脆弱部位を保持する人工染色体の構築を成功させなければ先に進むことができないので、次年度も引き続き、人工染色体の構築のためのステップを進めていく。また、上記スクリーニングで候補が得られなかった場合に備えて、loxP配列を挿入する染色体領域を変更することも準備している。今後、loxP配列の挿入が確認されれば、人工染色体を構築していくための次のステップとして、CHO細胞内のヒトX染色体上のHPRT遺伝子の破壊が必要となる。この遺伝子破壊もCRISPR/Cas9を使用する予定である。
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[Journal Article] Epstein-Barr Virus Lytic Reactivation Induces IgG4 Production by Host B Lymphocytes in Graves' Disease Patients and Controls: A Subset of Graves' Disease Is an IgG4-Related Disease-Like Condition.2018
Author(s)
Nagata, K., Hara, S., Nakayama, Y., Higaki, K., Sugihara, H., Kuwamoto, S., Matsushita, M., Kato, M., Tanio, S., Ishiguro, K., and Hayashi, K.
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Journal Title
Viral Immunol
Volume: 31
Pages: 540-547
DOI
Peer Reviewed
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